重大发现！西北大学揭秘人参皂苷Rh4如何通过肠道菌群抑制肠癌！

结直肠癌（CRC）是全球范围内导致癌症相关死亡的第二大因素，且在50岁以下人群中发病率逐年上升。研究表明，肠道微生物群与CRC的发展之间存在密切联系。CRC患者易出现微生物结构的失衡，尤其在细菌微生物群中表现明显。例如，一些被认为可能促进致癌过程的细菌，包括核梭杆菌、大肠杆菌和胃链球菌，在CRC患者的粪便样本中被发现含量较高。鉴于肠道微生物群与CRC之间存在的紧密联系，调整肠道微生物群已成为治疗CRC的一个极具潜力的策略。

肠道微生物群具备代谢天然产物的能力，进而影响其生物利用度及抗肿瘤疗效。反之，天然产物亦有潜力通过调节肠道微生物群预防和治疗多种类型的恶性肿瘤。人参，是一种具有悠久历史的传统草药，富含多种生物活性化合物，其中人参皂苷是其主要活性成分，特别是罕见的人参皂苷Rh4（Rh4），具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力，并能改善抗生素引起的肠道生态失调和肠道炎症。然而，Rh4对CRC及其相关肠道微生物群的影响尚未明确。

日前，一篇名为“Ginsenoside Rh4 inhibits colorectal cancer via the modulation of gut microbiota-mediated bile acid metabolism”的论文探讨了Rh4对CRC的影响及其通过调节肠道菌群抑制CRC的作用机制。

图1 论文首页

Rh4抑制AOM/DSS处理小鼠的CRC

研究结果显示，Rh4治疗显著提升了实验小鼠的存活率，有效缓解了体重的减少，并缩短了结肠的长度（图2B-F）。同时，经Rh4治疗的小鼠其结肠直肠肿瘤的数量与体积均小于对照组小鼠（图2G-H）。组织病理学分析表明，Rh4治疗显著减少了小鼠黏膜的糜烂程度、结肠组织隐窝的扭曲以及炎症细胞的浸润（图2I-J）。此外，Ki-67（一种细胞增殖的标志物）的免疫染色结果表明，接受Rh4治疗的小鼠结肠切片中阳性细胞的数量有所减少，暗示了肿瘤恶性程度的降低。因此，可以得出结论，Rh4具有抑制CRC发展的作用。

图2 Rh4抑制 AOM/DSS处理小鼠的 CRC

Rh4恢复AOM/DSS处理小鼠的肠道屏障功能

此外，研究还探索了Rh4对肠道屏障功能的作用。结果显示，Rh4治疗后，CRC导致的杯状细胞减少现象得到显著改善，肠道黏膜的稳态得以恢复（图3A）。肠道通透性分析揭示，Rh4治疗有效降低了FD4的荧光强度，缓解了CRC引发的小鼠肠道通透性异常升高（图3B）。与此相一致，IHC结果显示，Rh4能够调节紧密连接蛋白的分布。WB和RT-qPCR分析表明，Rh4能够直接上调Claudin-1和E-cadherin的表达（图3C-G），从而修复受损的肠道屏障功能并抑制脂多糖（LPS）的过度释放（图3H）。此外，研究发现Rh4能够抑制促炎细胞因子的释放（图3I-K），并促进抗炎细胞因子的释放。这些研究结果支持Rh4能够减轻由CRC引起的肠道屏障功能障碍和肠道炎症。

图3 Rh4恢复AOM/DSS处理小鼠的肠道屏障功能

Rh4逆转AOM/DSS处理小鼠的肠道菌群失调

通过聚类分析，研究确认了Rh4组与正常组之间存在显著的相似性（图4A-B）。以Shannon和Simpson指数为代表的Alpha多样性分析揭示了Rh4组的群落丰富度和多样性发生了变化，而Chao1指数则表明没有显著差异（图4C-E）。以PCA、PCoA和NMDS为代表的Beta多样性分析显示模型组、Rh4组和正常组之间存在分离（图4F-H）。这证实了Rh4对肠道菌群多样性的调节作用。其次，在门水平上，模型组表现出厚壁菌门丰度的增加，拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门丰度的减少，然而，Rh4处理增加了拟杆菌门的丰度（图4I）。在属水平上，阿克曼菌和普雷沃菌在Rh4处理组中富集，而脱硫弧菌在模型组中最为丰富（图4J）。综上所述，Rh4能够逆转微生物失调，增加益生菌的丰度并消除潜在的CRC病原体，从而抑制CRC。

图4 Rh4可逆转AOM/DSS处理小鼠的肠道菌群失调

Rh4抑制CRC依赖于肠道菌群

为深入研究Rh4-肠道菌群串扰在预防CRC中的作用机制，研究执行了系统性的分析，涵盖了抗生素治疗和粪便微生物移植（FMT）实验（图5A、图6A）。首先，通过16S rRNA分析验证了无菌小鼠模型的成功构建（图5B-C）。相较于未经抗生素处理的AOM/DSS模型小鼠，接受抗生素处理的模型组小鼠表现出肿瘤恶性程度的降低，具体表现为结肠长度的增加、肿瘤数量的减少以及肿瘤体积的缩小（图5D-F）。先前的研究指出，肠道菌群的耗竭会导致产生干扰素-γ的T细胞数量显著上升，而产生白细胞介素10的T细胞数量相应减少。因此，口服抗生素以耗竭肠道菌群能够显著减轻肿瘤负担。然而，在抗生素干预的条件下，Rh4治疗并未进一步改善模型组小鼠的结肠缩短和肿瘤恶性程度（图5D-F）。这些研究结果凸显了Rh4抑制CRC的效应依赖于肠道微生物群的存在。

图5 Rh4抑制CRC依赖于肠道微生物群

随后，研究在无菌小鼠中实施了粪菌移植（FMT），以探究经过 Rh4 修饰的肠道菌群对CRC的直接作用。在实验过程中，从供体小鼠获取的肠道菌群被引入到受体小鼠体内（图6A）。首先，16S rRNA 测序分析确认了Rh4修饰的肠道菌群在无菌小鼠体内成功定植。多样性分析揭示，与Model_FMT组相比，Rh4_FMT 组的 alpha 多样性显著提高，并且Rh4_FMT组与Model_FMT组之间存在明显的分离趋势。Rh4_FMT组还表现出拟杆菌门和阿克曼菌丰度的增加，以及厚壁菌门丰度的降低，这与直接施用Rh4所产生的肠道菌群变化相似。

值得注意的是，Rh4_FMT直接缓解了小鼠CRC引起的体重减轻和结肠缩短（图6B-E），并减少了小鼠结肠肿瘤的数量，有效抑制了CRC的发生（图6F-G）。Rh4_FMT 还能抑制小鼠结肠细胞的过度增殖，并改善小鼠结肠组织的组织病理学损伤。此外，IHC、WB（图6H-J）和RT-qPCR结果表明，Rh4_FMT 能显著提升肠道紧密连接蛋白的表达，修复肠道屏障功能的损伤。此外， Rh4_FMT抑制了LPS和促炎细胞因子的释放。这些发现证实了 Rh4_FMT对CRC具有直接的抑制作用，并强调了肠道微生物群是 Rh4 抑制肿瘤作用的关键因素。

图6 肠道菌群在Rh4抑制CRC中的关键作用

UDCA通过FXR-TLR4-NF-κB信号通路抑制结肠肿瘤发生

进一步的定量分析显示，模型小鼠TLR4蛋白表达显著增加，P65磷酸化水平异常升高。然而，补充Rh4及其甲酯化形式Rh4_FMT后，TLR4蛋白表达被显著抑制，同时P65磷酸化水平被恢复至正常水平。鉴于法尼醇X受体（FXR）作为胆汁酸（BA）的核受体，在人类肿瘤发生中扮演着关键角色，结果表明，Rh4及其甲酯化形式能够激活FXR受体，并抑制TLR4-NF-κB信号通。同时，UDCA治疗同样上调了FXR蛋白表达，并抑制了TLR4蛋白的过度表达，还抑制了P65的异常磷酸化（图7）。综上所述，该结果证实了UDCA作为Rh4通过调节A. muciniphila抑制结肠癌发生的关键介质。此外，UDCA通过激活FXR并抑制TLR4信号通路发挥其抗癌作用，从而有效抑制了CRC的进展。

图7 UDCA通过FXR-TLR4-NF-κB信号通路抑制CRC

结论

研究强调了Rh4作为肠道菌群调节剂的潜力，其通过依赖肠道菌群的方式对CRC产生抑制效果。这些发现为开发新型天然药物以预防和治疗CRC提供了新的视角。

参考文献：

Bai X, Duan Z, Deng J, Zhang Z, Fu R, Zhu C, Fan D. Ginsenoside Rh4 inhibits colorectal cancer via the modulation of gut microbiota-mediated bile acid metabolism. J Adv Res. 2024 Jul 3:S2090-1232(24)00265-0. doi: 10.1016/j.jare.2024.06.028