孔大陆教授组稿｜Cancer Cell：时空单细胞分析揭示了结直肠癌对免疫治疗的不同反应背后的细胞动态机制

编者按：北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）的张泽民院士联合北大肿瘤医院结直肠科武爱文主任，在Cancer Cell杂志上发表了题为“Spatiotemporal single-cell analysis decodes cellular dynamics underlying different responses to immunotherapy in Colorectal Cancer” 的研究论文，该研究利用22名接受PD-1抑制剂治疗的患者的多个连续单细胞样本，以绘制CRC患者局部和全身免疫的演变情况。

本期「专家组稿」由天津医科大学肿瘤医院孔大陆教授担任执行主编，与天津医科大学肿瘤医院田医生共同分享《Cancer Cell：时空单细胞分析揭示了结直肠癌对免疫治疗的不同反应背后的细胞动态机制》，为医者和患者提供更多参考。

【摘要】扩大免疫检查点抑制剂（ICB）在结直肠癌（CRC）中的疗效迫切需要对治疗反应性有全面的了解。研究团队分析了22名接受PD-1抑制剂治疗患者的多个连续单细胞样本，以绘制CRC患者局部和全身免疫的演变情况。在肿瘤中，该研究确定了表现出不同反应关联的协同细胞程序。具体而言，耗竭T（Tex）细胞或肿瘤反应性CD8+T（Ttr）细胞与治疗效果密切相关，且在PD-1阻断后，Tex细胞的比例变化与其他多种肿瘤富集细胞类型相关联。此外，该研究揭示了肿瘤中与血液相关的Ttr样细胞的低耗竭表型，并发现其较高丰度预示着更好的治疗效果。最后，基线时循环CD8+T细胞中较高的主要组织相容性复合体（MHC）II相关特征与更优的反应相关。该研究为新辅助PD-1抑制剂治疗后CRC 的细胞时空动态组学提供了见解。

01 研究背景

免疫检查点抑制剂来治疗癌症的有效性基于以T细胞为中心的抗肿瘤反应，局部肿瘤微环境（TME）的变化以及全身免疫功能的改变。越来越多的临床试验证明了免疫治疗在结直肠癌中的成功，特别是对于微卫星不稳定（MSI）或错配修复（MMR）缺陷患者。然而，大多数结直肠癌患者具有微卫星稳定（MSS）表型。与此同时，尽管MSI-H是广泛采用的ICB疗效预测标志物，并非所有MSI-H患者都经历了持久的反应，且病理反应也在一些MSS结肠肿瘤中观察到。因此，一项全面的对免疫治疗过程中细胞状态和分子动力学的理解将有助于制定新的策略以获益更广泛的CRC患者。

肿瘤生态系统由多种细胞类型组成，代表一个异质但高度组织的社区。局部肿瘤微环境内的不同细胞类型可以被调节同时接受治疗干预，免疫治疗过程中的伴发性重塑事件已经在多种癌症类型中得到了揭示，包括乳腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌以及MMR的结肠癌。然而，这些研究大多分别研究离散的细胞团及探索潜在的细胞相互作用，缺乏免疫治疗干预下TME细胞成分变化的系统描述。

在该研究中，课题组利用了多模式单细胞转录组测序（scRNA-seq）和单细胞TCR测序（scTCR-seq）技术，以破译接受新辅助PD-1阻断治疗的CRC患者的改变。研究团队共收集了169例匹配的血液、肿瘤组织及瘤旁正常组织的样本，详细描绘了PD-1新辅助免疫治疗的结直肠癌患者中免疫系统的局部与系统时空变化特征。

02 主要研究结果

PD-1阻断治疗后的结直肠癌单细胞图谱动态变化

975275个高质量单细胞转录组结果揭示了六种主要的细胞类型：T细胞、B细胞、先天性淋巴细胞（ILCs）、髓系细胞、基质细胞和上皮细胞。在肿瘤中，研究者观察到不同反应关联的四种主要免疫细胞类型。治疗过程中，完全缓解（CR）组和部分缓解（PR）组比病情稳定组（SD）表现出更高的T细胞浸润水平。值得注意的是，两名MSS患者经历了肿瘤显著消退并达到了CR，与其他患者相比，其T细胞比例很高。接下来，作者研究了在PD-1阻断治疗后肿瘤组织内主要免疫细胞类型的动态变化。在评估为SD的肿瘤患者中，髓系细胞的丰度展现出特别的增加。对于B细胞和T细胞，丰度偏差则不同。治疗后，CR肿瘤中T细胞比例降低，PR肿瘤中T细胞比例增加，而B细胞显示相反的趋势。这些观察结果共同证明了固有的细胞异质性不仅存在于反应组和无反应组，也存在于反应组内部。

肿瘤生态系统中的协同细胞程序变化

研究者采用了一种基于非负矩阵分解（NMF）的方法来捕获TME中的细胞亚群，并检查这些程序是否与治疗效果相关（STAR方法）。在肿瘤样本中，共识别出五种细胞程序（NMF1-5）。TME中与免疫治疗效果密切相关的三个细胞程序为三级淋巴结构程序（TLS-like program）、肿瘤富集程序（Tumor-enriched program）和组织重构程序（Tissue-reconstruction program）。对其中17名患者进行的染色分析发现，CR和PR患者在治疗后TLS面积和计数的增加。然而，CR和PR肿瘤在组织重构程序和肿瘤富集程序方面具有不同的动力学特征。在治疗后的CR肿瘤中，组织重构程序信号更强，但肿瘤富集程序信号较弱，意味着恶性细胞的有效根除及正常组织样环境的建立。相比之下，在治疗后的PR肿瘤中，该现象正好相反。对每个患者的长期随访都观察到了类似的现象。有趣的是，在部分治疗反应组患者中，与MSI组相比，MSS组的患者具有更高的组织重构程序活动和较低的肿瘤富集程序活动。这意味着前者TME中的免疫反应更为局限。这些分析结果共同支持了PD-1抑制治疗诱导了TME内的细胞类型及细胞程序变化的观点。

肿瘤内耗竭CD8+T细胞的反应关联性

研究团队观察到，在肿瘤富集程序下，在所有TME细胞类型中，Tex（c23）、内皮细胞（c71、c70）和Th17（c07）细胞显示出最高的程序负荷。值得注意的是，Tex细胞具有最高的（AUC）值，其次是pDC（c55）和周细胞（c81）。这一发现与Tex细胞动力学与治疗效果之间的关系是一致的。在基线水平，CR肿瘤内包含更高比例的浸润型CD8+Tex细胞。此外，Tex浸润水平和克隆扩增程度与肿瘤消退密切相关。尤其是，4例MSI的PR患者，其Tex细胞丰度与其他PR患者相比一致性较好。这些观察结果进一步表明，细胞组成和状态是补充MSI/MSS的有效指标。

在有效免疫治疗下肿瘤反应性CD8+T细胞在外周血的变化

研究团队进一步检查了外周血中Ttr-like细胞亚群，在循环CD8+T细胞中鉴定出一组与MHC II相关的基因特征，可以在治疗前有效预测治疗反应。尽管患者之间存在异质性，观察结果显示外周血中Ttr-like细胞很可能被激活，类似于前体，来介导产生抗肿瘤免疫反应。在治疗反应组内部，与PR组相比，CR肿瘤组具有更丰富的血液相关Ttr-like细胞。在某些CR病例中，这些血液相关前体持续存在于治疗后，即大多数恶性细胞被消除时，这表明Ttr样细胞介导免疫保护长期存在。相比之下，PR患者中，大多数患者的血液相关Ttr-like细胞数量有限，表明这些患者的全身免疫反应参与度有限。

03 总结与展望

研究团队详细描述了抗PD-1新辅助免疫治疗后的细胞和分子动力学特点。尤其是，CR和PR患者的鉴别在临床上至关重要，且具有很大的科学价值，这可能有助于实现器官功能的保存并减轻许多患者的生理负担。功能验证和更多的队列研究需要进一步来验证研究结果。