喻翠云/魏华教授团队《ACS Nano》：基于二甲双胍的多功能纳米平台作为DNA损伤放大器，用于最大化放射免疫治疗以克服放疗耐受

在临床癌症治疗中，近半数的患者会接受放射治疗（RT）或RT与其他治疗方式相结合的治疗方式。放射治疗（RT）已经被视为是一种通过引起直接DNA损伤来激活抗肿瘤免疫的有效策略，但由于环状GMPAMP合酶（cGAS）对胞质DNA（cDNA）的识别受损，其通常具有较低的反应率。因此，如何克服放疗抵抗，实现最大化的放射免疫治疗，对于临床上肿瘤的放射治疗方案改善具有重要的意义。

近日，湖南中医药研究院喻翠云教授和南华大学魏华教授团队在《ACS Nano》杂志（IF=15.8）在线发表了题为“A Metformin-Based Multifunctional Nanoplatform as a DNA Damage Amplifier for Maximized Radio-Immunotherapy to Overcome Radiotherapy Resistance”的工作。该研究报道了一种基于二甲双胍(MET)的多功能纳米复合物CS-MET/ siTREX1 (CSMT）用于放大初始DNA损伤信号，最终增强放射治疗（RT）诱导的抗肿瘤免疫。这项研究的独特性在于CSMT作为一种特异性DNA损伤放大因子，它可以促进cDNA的积累，从而使放射免疫疗法最大化，并避免RT的耐受。

尽管RT在肿瘤治疗中的地位日益突出，但其治疗效果并不理想。RT抵抗可能导致局部治疗失败，甚至癌症复发。一般来说，RT的效果取决于细胞DNA损伤的程度及其累积效应。肿瘤部位存在多种因素诱导放疗抵抗，主要包括DNA损伤修复，胞浆DNA清除，肿瘤微环境免疫抑制等。如，高剂量的辐射会诱导核酸外切酶TREX1的表达上调，加速清除胞浆DNA，抑制抗肿瘤免疫。因此，在肿瘤部位积累足够多的RT诱导的cDNA可能使cGAS-STING途径激活的抗肿瘤免疫实现最大化。

本研究使用双胍修饰的壳聚糖（CS-MET）作为载体和3'-5'DNA核酸外切酶TREX1 siRNA（siTREX1）作为治疗基因，构建多功能纳米复合物CS-MET/siTREX1（CSMT）用于特异性放大DNA损伤，促进cDNA积累，最终增强RT诱导的抗肿瘤免疫。

CSMT纳米复合物不仅通过MET修饰提高了基因转染效率，而且还显示出协同治疗效果，包括MET对DNA修复的抑制作用和siTREX1对cDNA清除的衰减作用。CSMT纳米复合物在Hepa1-6近端/远端肿瘤模型中显示出显著的抗肿瘤作用，对原发肿瘤的肿瘤生长抑制（TGI）值为99.1%，并通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）显著损害远端肿瘤生长，促进肿瘤相关中性粒细胞（TAN）极化，并刺激肿瘤特异性记忆T细胞生成（图1）。

图1. CSMT纳米复合物的抗肿瘤机制示意图（a：放疗抵抗的一般机制；b：CSMT的抗肿瘤作用机制）

在本研究中，研究团队首先通过各种手段表征了CSMT纳米粒的成功合成，并证实其具有较高的稳定性（图2）。为了探讨CSMT能否顺利在细胞内产生预期效果，研究团队分别从细胞摄取水平，蛋白表达水平以及纳米复合物与溶酶体共定位情况等方面考察了CSMT纳米复合物的胞内行为，结果表明，该纳米复合物显著增加siTREX1的溶酶体逃逸水平，增加其转染效率（图3）。

图2. CSMT纳米粒的合成路线及表征

图3. CSMT纳米复合物的胞内行为研究

为了探究CSMT纳米复合物能否在联合放射治疗时起到促进胞浆DNA累积，激活STING通路的效果，研究团队检测了CSMT联合放射治疗（CSMT + R）处理后细胞增殖与周期的变化，并检测了相关蛋白水平以及胞浆中DNA水平的变化情况，结果表明，CSMT + R能显著抑制肿瘤细胞的增殖，阻断细胞周期至G2/M期，增加细胞DNA损伤，抑制DNA损伤修复蛋白酶RAD51的表达，最终增加胞浆中DNA的累积，激活cGAS-STING通路（图4）。

图4. CSMT纳米复合物的体外抗肿瘤效果分析

此外，研究团队还检测了CSMT + R治疗诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡的情况以及诱导DC细胞成熟的情况。结果表明，CSMT + R能够显著诱导CRT暴露，HMGB1的外排以及ATP的释放，并显著诱导DC的成熟（图5）。

图5. CSMT的抗肿瘤免疫效果研究

接下来，研究团队首先验证了CSMT + R治疗方案具有显著的抗肿瘤效果，对原发肿瘤的肿瘤生长抑制（TGI）值为99.1%，并通过诱导免疫原性细胞死亡（ICD）显著损害远端肿瘤生长（图6）。通过对肿瘤部位蛋白水平及细胞因子分析，发现CSMT + R能显著激活STING通路，释放IFN-β（图7）。

图6. CSMT纳米复合物的体内抗肿瘤效果验证

图7. CSMT + R激活STING通路情况分析

研究团队通过流式细胞术分析肿瘤组织、淋巴以及脾脏部位的免疫细胞分布情况，实验结果表明CSMT + R能最大程度的激活抗肿瘤免疫，诱导DC细胞成熟，促进CD8⁺T细胞表达增加以及肿瘤相关中性粒细胞（TAN）极化，并刺激肿瘤特异性记忆T细胞生成。值得注意的是，实验结果表明CSMT + R“治愈”后的小鼠能够免受同源肿瘤细胞的再激发（图8）。

图8. CSMT + R治疗小鼠的免疫效果分析

最后，研究团队通过体内抗体中和实验再次验证了CSMT + R联合治疗发挥抗肿瘤作用的机制。结果表明，在CSMT + R治疗通过激活STING通路，诱导抗肿瘤中性粒细胞的极化以及CD8⁺T细胞活化来发挥抗肿瘤作用（图9）。

图9. CSMT + R治疗的抗肿瘤作用机制探究

湖南中医药研究院喻翠云教授，南华大学魏华教授为该论文的通讯作者，何双燕研究生，黄蕴博士生和刘佳研究生为该论文的共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金项目、湖南省自然科学基金项目、湖南省科技创新领军人才计划项目、湖南省科技重点发展计划项目等项目的支助。

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