【论肿道麻】CRISPR：基本原理及其对麻醉学的影响

CRISPR是一种原核生物的适应性免疫机制，现已被广泛应用于遗传性疾病和癌症的治疗研究，并在脓毒症和慢性疼痛等领域展现出潜力。2025年3月，《British Journal of Anaesthesia》杂志发表了一篇名为《CRISPR: fundamental principles and implications for anaesthesia》的综述，系统阐述了该技术的基本原理，以及CRISPR在麻醉学领域中的应用前景。

CRISPR，即成簇规律间隔短回文重复序列（clustered interspaced short palindromic repeats），是一种允许修改个人基因组的技术，已经改变了遗传性疾病的治疗方式。世界上第一个CRISPR疗法Casgevy（依扎格隆基因自体干细胞），被批准用于治疗镰状细胞病和输血依赖性地中海贫血。目前，CRISPR临床试验正在肿瘤学、血液学、心脏病学、传染病和罕见病等众多领域中进行，CRISPR技术在麻醉学领域有多种直接的潜在应用，尤其是在慢性疼痛管理和危重病治疗等方面。

CRISPR技术的基本原理

1.1 CRISPR的分类

在自然界中，CRISPR系统是细菌和古细菌（统称为原核生物）的适应性免疫系统，负责捕获入侵病毒和质粒的遗传物质并整合到遗传阵列中，这一阵列使原核生物能够防御未来的感染。其编码的效应蛋白能够切割外源核酸，这些效应蛋白也是CRISPR系统分类的基础。CRISPR系统分为两类：第一类利用多种蛋白质切割核酸，包括I型、III型和IV型三个亚型；第二类仅使用一种效应蛋白，包括II型、V型和VI型三个亚型。Cas9属于第二类II型CRISPR系统，是目前基因编辑疗法的主要工具。

图1. II型CRISPR原核生物适应性免疫示意图

1.2 CRISPR的适应性免疫

原核生物的基因组不断受到病毒和质粒的攻击，为了应对这种威胁，原核生物进化出了以CRISPR阵列形式存在的适应性免疫系统（图1）。CRISPR阵列由CRISPR相关基因（Cas）组成，位于富含AT的前导序列附近。Cas蛋白识别病毒DNA中的原间隔序列邻近基序（PAM），确保切割针对的是外源DNA。识别PAM后，Cas蛋白将病毒DNA切割成原间隔序列，并将其整合到CRISPR阵列中，形成间隔序列。间隔序列之间由短回文重复序列分隔。

当病毒再次侵染时，CRISPR阵列转录成前体CRISPR RNA（pre-crRNA）。在II型系统中，反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）与前体crRNA结合，形成双链RNA，随后被RNase III加工成成熟的crRNA和tracrRNA。crRNA包含来自先前感染的间隔序列，与tracrRNA和Cas蛋白形成复合物，结合并切割入侵的病毒DNA，实现免疫防御。

在基因工程中，crRNA和tracrRNA被融合成单链向导RNA（gRNA）。gRNA包含一个20个核苷酸的靶向元件，该元件决定了CRISPR核酸内切酶在基因组中的结合和切割位置。gRNA和Cas9形成的复合物会搜索并结合靶DNA，当识别出PAM序列且gRNA的5'端20个核苷酸与靶DNA之间足够互补时切割DNA。值得注意的是，Cas9能够容忍gRNA与靶DNA的部分错配，这就导致可能在基因组的非靶位点发生脱靶切割。

CRISPR系统通过精准的DNA识别和切割，为原核生物提供了强大的适应性免疫机制，同时也为基因编辑技术奠定了基础。

1.3 CRISPR技术

基因组工程能够实现对DNA序列的永久性修改。只要改变gRNA靶向区域的序列，Cas9等核酸酶就能被重新定向到基因组中任何与PAM序列相邻的位点。传统的基于CRISPR的方法通过产生位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），并依赖细胞内的DNA修复途径来实现基因组修饰。新的CRISPR技术例如碱基编辑、先导编辑、表观遗传调控以及RNA编辑，能够在不需要DSBs的情况下进行精确且多样的基因组工程操作。

图2. CRISPR技术

1.3.1 通过双链断裂进行基因编辑

CRISPR能够在期望的基因组位置诱导DNA双链断裂（DSBs），通过引发细胞对DSB的修复反应来实现对靶基因组的修饰。DSB最常见的修复机制是非同源末端连接（NHEJ）（图2a）。NHEJ过程直接重新连接断裂的DNA末端，但可能导致插入或缺失（indel），从而破坏基因功能。另一种修复方式是微同源介导的末端连接（MMEJ），它利用微同源序列来对齐切割片段并修复DNA，但可能导致更大的indel。如果indel发生在基因的编码序列或内含子剪接序列中，就可能破坏或敲除该基因。因此，CRISPR可以通过靶向产生indel来使DNA序列失活。不过，产生DSB可能会导致潜在的不良基因毒性，如染色体易位或基因组不稳定。

CRISPR还可通过同源定向修复（HDR）精确替换遗传物质（图2b）。HDR需要提供包含目标修饰的同源DNA模板，在DSB位点进行修复。然而，HDR效率较低，且主要在细胞分裂时活跃，而NHEJ则始终活跃。因此，提高HDR效率是当前研究的重点。CRISPR通过DSBs触发细胞修复机制，为基因编辑提供了强大工具，但需平衡精准性和潜在风险。

1.3.2 无需双链断裂的基因编辑

通过失活Cas9的一个或两个核酸酶结构域，就能产生可以结合靶DNA但不切割DNA的dCas9，或只切割单链DNA的切口酶（nickase）。这些变体为碱基编辑和先导编辑提供了基础，无需诱导双链断裂（DSBs）即可实现精准基因修饰。

CRISPR碱基编辑器利用Cas9切口酶或dCas9结合靶DNA，并通过融合的脱氨酶结构域对单链DNA进行脱氨反应（图2c）。胞嘧啶碱基编辑器可催化CG转换为TA，腺嘌呤碱基编辑器可催化AT转换为GC，从而纠正致病突变。但是其编辑窗口仅限于几个核苷酸，并且这些修饰只涵盖了所有可能碱基转换中的一部分。

CRISPR先导编辑器能够在不需要供体DNA模板的情况下，改变单个核苷酸并实现所有可能的碱基转换，同时还能在目标DNA中引入小的插入或缺失（indel）（图2d）。先导编辑通过Cas9切口酶、逆转录酶和先导编辑gRNA（pegRNA）实现。pegRNA结合DNA双链并切割其中一条链，其3′端延伸部分通过逆转录生成包含编辑的DNA-RNA配对，随后整合到基因组中。先导编辑可纠正单碱基突变和移码突变，但仅限于短序列插入（小于50个碱基对），且对大片段的插入效率较低。这些技术为精准基因编辑提供了新工具，避免了DSBs带来的潜在风险，但在编辑范围和效率上仍有改进空间。

1.3.3 表观基因组和转录组工程

CRISPR可通过表观遗传调控增强或抑制基因表达（图2e）。CRISPR激活（CRISPRa）将转录激活结构域融合到dCas9上，增加基因表达；CRISPR抑制（CRISPRi）则通过转录抑制结构域与dCas9融合而降低基因表达。CRISPRa/CRISPRi的调控通常是短期的，但CRISPRoff和CRISPRon系统可实现更长期的基因沉默和重新激活，为干预表观遗传疾病提供了新工具。

此外，CRISPR还可用于RNA编辑。这通常涉及一种失活的2类VI型CRISPR系统，即dCas13，它与RNA特异性脱氨酶系统ADAR2融合。当dsRNA被dCas13 gRNA结合时，这一过程就开始了。gRNA在其互补序列中携带期望的编辑信息，这会导致RNA与gRNA之间出现错配。这些错配会触发ADAR2进行RNA编辑。这项技术可以在不改变基因组本身的情况下纠正突变的基因产物。然而，RNA编辑具有高度的瞬时性，可能需要重复给药以维持疗效。

这些技术扩展了CRISPR的应用范围，为基因表达调控和RNA治疗提供了新途径，但在持久性和效率上仍需优化。

CRISPR的临床应用及局限性

CRISPR技术的一个关键优势在于，它有可能成为治疗遗传疾病的一种治愈性疗法。目前市场上有多种针对不同适应症的基因药物，采用传统基因疗法、反义寡核苷酸（oligos）和小干扰RNA（siRNA）等技术，但这些疗法都受到效果持久性的限制。对于基因疗法，携带基因替代的载体随着时间的推移会在目标组织中被稀释，并且由于免疫原性问题，通常无法重复给药。反义寡核苷酸和siRNA则需要重复给药以维持效果，患者需要终身接受治疗以维持疗效。

而CRISPR的优势在于其持久性和精准性，通过一次性编辑有望实现长期疗效。为了使CRISPR作为一种药物发挥作用，基因组编辑机制必须到达靶细胞和组织，这可以通过体外或体内递送实现。

图3. CRISPR递送模式

体外递送（图3a），基因工程在体外进行，包括提取干细胞，在实验室中对细胞进行修饰，然后将修饰后的细胞回输到患者体内。这个过程很复杂，需要定制化生产，并且患者需要接受化疗。整个治疗过程可能需要长达1年的时间。不过，体外疗法避开了体内递送的挑战，适用于血液疾病和癌症，已在临床试验中展现出功能性治愈的潜力。

体内递送（图3b），基因工程在体内进行。与血液不同，肌肉和大脑等其他组织的细胞无法提取出来进行体外编辑，对于大量遗传疾病的治疗方法，需要将基因组工程组件靶向递送至体内。体内递送可以直接将CRISPR组件递送至目标组织，这一过程比体外递送更简单、成本效益更高。目前有多项体内CRISPR疗法的临床试验正在进行中，但尚未有获得监管部门批准的产品。

尽管基于CRISPR的技术功能不断扩展，但将CRISPR基因编辑器体内递送至特定组织仍然是一个挑战。目前，CRISPR的临床应用主要有两种递送载体：脂质纳米颗粒（LNPs）和腺相关病毒（AAVs）。LNPs可有效包裹mRNA，将其递送至肝脏等器官，然而，LNPs在向肝脏以外的组织进行特异性递送时存在困难。AAVs可递送至肌肉、心脏、大脑和肺等多种组织，但有效载荷容量有限，难以携带大型Cas9蛋白。为解决这一问题，研究人员正在开发更小的CRISPR系统（如Cas12f和Cas12j），以适配AAV载体并扩展其应用范围。此外，AAVs可能引发免疫反应，虽然其免疫原性相对较低，但仍存在激活先天免疫系统和补体系统的风险，导致细胞因子风暴、肝毒性等不良反应。

CRISPR的安全性

CRISPR技术的安全性是其临床应用的核心考量，尤其是组织和基因组靶向特异性。脱靶效应是CRISPR的主要风险之一，可能因gRNA靶向特异性不足而导致非目标核酸被修饰。

图4 . CRISPR脱靶位点

脱靶效应有以下几种类型：

1.双链断裂（DSBs）：脱靶DSBs可能导致染色体易位、插入/缺失（indel）和基因组不稳定性（图4a和b）。

2.碱基编辑：突变可能发生在目标位点附近，引入旁观者修饰（图4c），甚至通过不依赖gRNA的机制改变单链DNA。

3.先导编辑：脱靶效应较少，但可能因逆转录酶活性过度将tracrRNA支架整合到基因组中。

4.表观遗传修饰：脱靶可能导致基因表达异常，影响细胞功能（图4d）。

5.RNA编辑：脱靶效应较少被关注，但可能破坏非目标RNA的翻译或功能。

有多种方法可以最大限度地减少脱靶潜力，例如使用高保真Cas核酸酶和优化gRNA设计；选择在人类参考基因组中预测脱靶最少的gRNA；通过化学修饰gRNA提高特异性；在生物学相关背景下实验验证潜在脱靶位点。

人类基因组中存在大量单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（indels），可能导致参考基因组中PAM位点的消失或新PAM位点的出现。研究表明，个体水平的遗传变异可能创造约1150万个新PAM位点，同时消除约2200万个PAM位点。这意味着基于参考基因组设计的gRNA可能在某些个体中产生脱靶效应。

为减少脱靶风险，设计针对个体基因组特异性的gRNA是一种有效策略。这种方法可提高CRISPR疗法的精准性和安全性，尤其是在治疗遗传性疾病时。

CRISPR技术在麻醉学领域的应用

3.1 CRISPR 治疗患者对麻醉管理的影响

2023年，Casgevy成为首个获批的CRISPR疗法，用于治疗镰状细胞病和输血依赖性β-地中海贫血。该疗法通过靶向BCL11A基因的红系特异性增强子区域，降低其表达，从而提高胎儿血红蛋白水平，显著改善患者症状。Casgevy治疗费用约为220万美元，治疗周期可能长达1年。相比之下，镰状细胞病的终身医疗费用约为160万至170万美元。尽管费用高昂，但该疗法显著改善了患者的生活质量，并减少了并发症的发生。

Casgevy的制造过程包括从镰状细胞病或β-地中海贫血患者体内通过单采术分离CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。随后，使用CRISPR-Cas9编辑BCL11A基因，增加胎儿血红蛋白的产生。之后，患者接受白消安进行清髓预处理后，回输编辑后的HSPCs以实现持久植入。

该疗法使接受治疗的镰状细胞病和β地中海贫血患者的胎儿血红蛋白水平升高，显著减轻了症状负担，提高了生活质量。同时，较高的胎儿血红蛋白水平会使这些患者的氧合血红蛋白解离曲线左移，即血红蛋白对氧的亲和力增加，而氧释放能力降低。因此，麻醉诱导前需延长预氧合时间，并允许适度高碳酸血症以促进氧释放，防止组织缺氧。

这种新型疗法是35年多基础科学研究的成果，涉及细菌遗传学、基础生物化学和人类免疫学等多个领域。Casgevy彰显了基础研究对临床医学进步的重要价值。

图5. CRISPR在肿瘤麻醉学中的应用

随着Casgevy的获批，麻醉医生将越来越多地护理接受CRISPR治疗的患者（图5a）。首批CRISPR临床试验主要集中在血液病、肿瘤、先天性疾病和传染病领域，通常针对对传统疗法无效的重症患者。例如，CRISPR疗法NTLA-2001正在评估用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性、心肌病和心力衰竭；BEAM-201和CTX112分别用于治疗T细胞和B细胞恶性肿瘤。

接受CRISPR治疗的患者可能存在晚期基础疾病（如心力衰竭、肿瘤负荷）或既往治疗副作用（如贫血、肺毒性、免疫抑制）。此外，CRISPR治疗本身可能引发并发症，如脱靶效应或载体相关不良反应。尽管首批Casgevy患者未发现脱靶效应，但其潜在风险（如血液学或肿瘤学异常）可能在数年后显现。

对于围手术期和危重患者来说，最显著的风险可能来自CRISPR疗法的递送方法和载体引起的副作用及全身反应。例如，用于编辑造血干细胞的疗法（如治疗癌症或血液疾病）通常需要在回输体外CRISPR编辑细胞之前进行淋巴细胞清除或骨髓消融治疗。在Casgevy治疗镰状细胞病和β-地中海贫血患者时，3级或4级不良事件发生率高达95%（镰状细胞病）和88%（β-地中海贫血），常见问题包括口腔炎、发热性中性粒细胞减少症和血小板减少症，这些对疼痛控制、抗生素管理和区域麻醉提出了更高要求。这些反应也可能由递送CRISPR编辑机制的载体（如AAVs和LNP）引起。尽管AAVs的免疫原性不强，但它们可能激活先天免疫系统和补体系统，引发细胞因子风暴、肝毒性或背根神经节毒性。例如，有一例病例报告显示，一名晚期肌肉萎缩症患者在接受高剂量AAV-CRISPR治疗后出现心功能不全和急性呼吸窘迫综合征并死亡。尽管尸检分析未发现AAV抗体或T细胞反应，提示并非免疫介导的反应，且肝脏中的转基因表达极少。但人们对CRISPR介导的毒性仍存在担忧。

3.2 CRISPR 在危重症患者中的应用

除了护理接受过CRISPR治疗的患者外，麻醉医生还可能运用CRISPR技术治疗危重症患者。脓毒症和传染病引起的危重疾病是全球ICU入院的主要原因。虽然脓毒症的初始复苏治疗是标准化的，但快速识别病原体并开始适当的治疗通常是挽救生命的关键。CRISPR可用于核酸检测，CRISPR诊断技术已被证明能够快速、可靠地识别脓毒症病原体，助力早期诊断和精准抗菌治疗。

CRISPR技术有望在败血症期间实现实时体内免疫调节。Myd88在调节机体对病原体的免疫反应中起重要作用，高表达的Myd88与败血症死亡率增加相关。在小鼠模型中，抑制Myd88已显示出对脓毒症的预防性保护作用。研究表明，通过AAV或LNP递送CRISPR系统，可靶向抑制Myd88基因，调节Toll样受体信号通路，降低肿瘤坏死因子-α和ICAM-1水平，从而改善脓毒症病程。

在临床实践中，麻醉医生可以结合自身的专业技能，参与到基于CRISPR技术的危重症治疗中，如协助进行CRISPR系统的递送、监测治疗效果和不良反应等，为危重症患者的救治提供新的思路和方法。 

3.3 CRISPR在慢性疼痛治疗中的应用

慢性疼痛的治疗常受限于药物的副作用和患者耐受性，而CRISPR技术为此提供了新的解决方案。通过对疼痛相关基因的研究，科学家已发现多个潜在治疗靶点，其中最突出的是编码钠通道Nav1.7的SCN9A基因。

Nav1.7是在初级传入伤害性神经元中表达的三种电压门控钠通道之一，在疼痛信号传递中起关键作用。尽管Nav1.7是慢性疼痛治疗的一个有吸引力的靶点，但先前的小分子抑制剂因生物利用度低以及Nav亚型之间的相似性导致缺乏特异性而未能成功。针对Nav1.7的抗体疗法也未能成功，因为成功的抗体结合并未转化为理想的钠通道抑制效果。最近，CRISPR-dCas9通过AAV递送系统在体内表观遗传学上抑制Nav1.7，显著减轻了小鼠模型的慢性疼痛，且未影响运动功能或引发副作用。这一突破为难治性疼痛的治疗带来了希望。

CRISPR的另一个潜在疼痛靶点是脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）染色体区域。FAAH是参与痛觉、焦虑和抑郁的生物活性脂质的主要分解代谢酶。FAAH基因中一种常见单核苷酸多态性（SNP）的纯合子携带者已被证明对术后镇痛药的需求减少。此外，最近的研究在一名终身对疼痛不敏感且无焦虑的患者中发现了人类FAAH染色体区域的突变。这种长链非编码RNA（lncRNA）FAAH-OUT被发现通过DNMT1依赖的DNA甲基化在调节FAAH表达中具有表观遗传作用。通过CRISPR-Cas9编辑FAAH染色体区域，可减少FAAH表达，从而可能缓解疼痛和焦虑。

尽管减少Nav1.7和FAAH的表达在疼痛治疗中显示出前景，但仍需进一步研究以证明其临床疗效。CRISPR与慢性疼痛治疗相关的一个重要特点是，麻醉医生能够以组织特异性的方式熟练地递送潜在的CRISPR疗法（图5b）。慢性疼痛治疗通常使用超声和透视技术将机械、化学或热疗递送至目标神经，这种组织特异性递送可最大限度地降低组织毒性风险。若CRISPR治疗无效，还可随后进行标准神经消融治疗，进一步降低患者风险。

3.4 CRISPR在肿瘤麻醉学中的创新应用

CRISPR技术在癌症治疗中展现了巨大的潜力。随着CRISPR从实验室研究走向临床应用，它作为抗癌工具的可能性越来越大。CRISPR系统可以在体外和体内高效杀死癌细胞，且不受肿瘤的表观遗传状态、突变数量或化疗耐药性的影响。例如，在胶质母细胞瘤的研究中，CRISPR显著提高了小鼠的生存率。这种方法通过设计针对肿瘤特异性突变的gRNA，精准杀死癌细胞。研究还发现，利用放化疗后肿瘤的独特遗传特征，可以设计出更有效的CRISPR治疗方案。这项研究为癌症治疗开辟了新途径，也为麻醉医生提供了新的研究方向。

将CRISPR疗法递送到中枢神经系统（CNS）等复杂部位是一大挑战，但麻醉医生在神经轴给药和超声引导下的精准治疗方面具有独特优势。通过鞘内注射或局部递送，CRISPR可以实现对CNS肿瘤的微创治疗。这种方法也可以用于其他部位的肿瘤治疗。结合生物发光标记物的CRISPR技术，还能帮助外科医生更清晰地看到肿瘤边界，实现精准切除。

小结

CRISPR技术作为基因编辑领域的革命性工具，正在迅速改变医学研究和临床治疗的格局。本文综述了CRISPR的基本原理及其在麻醉学和重症医学中的潜在应用，包括免疫调节、疼痛管理以及癌症治疗等方面。CRISPR不仅为精准医学提供了新的可能性，还为复杂疾病的治疗开辟了创新路径。

CRISPR技术的出现为麻醉学专业的发展带来了新的机遇和挑战。随着越来越多的患者接受CRISPR治疗，麻醉医生需要深入了解CRISPR技术的原理、应用和潜在风险，以提供更加精准、安全的麻醉管理。这将促使麻醉学专业不断拓展知识领域，加强与其他学科的交叉融合，如遗传学、分子生物学、肿瘤学等。麻醉医生凭借在药物递送、生理监测和多学科协作方面的专业技能，有望在CRISPR技术的临床应用中发挥重要作用，成为CRISPR治疗团队的关键成员。例如，在CRISPR治疗的临床试验中，麻醉医生可以参与制定治疗方案，评估患者的麻醉风险，监测治疗过程中的不良反应，为研究的顺利进行提供保障。此外，CRISPR技术的发展也将推动麻醉学研究的深入开展，探索新的麻醉靶点和治疗方法，为麻醉学的理论和实践创新提供支持。

尽管CRISPR在实验室研究中展现了巨大的潜力，但其在临床中的实际应用仍面临技术瓶颈和伦理争议。例如，脱靶效应可能引发不可预见的基因突变，而递送系统的效率和组织特异性仍需进一步优化。此外，CRISPR技术的长期安全性和伦理问题也亟待解决。未来，跨学科合作将至关重要，麻醉学家、基因编辑专家和伦理学家需要共同努力，推动CRISPR技术的安全转化和临床应用。总体而言，CRISPR技术为精准医学和个体化治疗提供了新的工具，但其广泛应用仍需时间和技术突破。