西北工业大李林教授Biomaterials：基于蛋白限域荧光效应“榫卯”组装策略增强线粒体光动力治疗

临床前研究表明，基于光子学诊疗已成功实现肿瘤光消融，为癌症治疗等再生生物医学应用开辟了新途径，但当前境况仍不尽理想。主要挑战在于大多数相关系统受到多组分设计与合成复杂性、治疗效率低、光活性变化、药物摄取效果及生物安全性等问题的限制；特别是，导致光活性的超快事件的结构基础及其光敏分子构象仍然难以捉摸，电子激发态下光敏药物晶体结构尚未明确。更重要的是，光敏药物缺乏与癌症密切相关的亚细胞定位（如线粒体），极大地阻碍了对其抗肿瘤机制的全面阐释。这些因素共同制约了光敏药物在除特定皮肤病适应症以外的广泛临床应用，尤其是鉴于对纳米颗粒在器官、循环系统及肿瘤间相互作用机制的深层次理解尚待深化，进而阻碍了其作为高效癌症诊疗手段工具的进一步发展。

为此，西北工业大学李林教授、傅莉教授和西北大学陈希教授等人，结合蛋白质口袋预测与光功能材料设计理念，提出基于蛋白限域荧光效应的“榫卯”二级组装工程（TASE）策略，通过将功能性光敏染料引入白蛋白中组装成光敏蛋白缀合物，有效调控染料激发态释能途径，提高其吸收光子的能量利用效率，实现光转换和激活。进一步，光敏染料-蛋白缀合物通过“榫卯”结合方式，二次组装成光敏蛋白复合物，使其能够特异性靶向肿瘤组织，并在细胞器中实现精准积累，从而改善光敏药物在患者体内的生物分布和药代动力学，显著降低治疗阈值剂量，最大限度减少副作用并提高治疗效果。研究表明，该光敏蛋白复合物通过PDT效应产生ROS，有效地抑制线粒体活性并损伤肿瘤血管，引发细胞的代谢和氧化应激危机，实现对实体瘤的有效光消融及抗肿瘤转移。该研究充分阐明了化学、物理和生物界面的跨学科问题，不仅为自然或人工改造光吸收利用中的生物工程光敏蛋白调控提供了重要理论基础，同时为细胞器靶向肿瘤特异性光敏蛋白在生物医学应用中的工程化开辟了新的视野。该研究成果以“Albumins Constrainting the Conformation of Mitochondria-targeted Photosensitizers for Tumor-specific Photodynamic Therapy”为题，发表在Biomaterials上。论文共同第一作者是西北工业大学博士研究生方斌（现厦门大学博士后）和西北工业大学柏桦副教授。

【染料与蛋白二级“榫卯”组装工程用于肿瘤线粒体光疗的新策略】

蛋白质，作为生命体系中的精密分子机器，凭借其卓越的精确度和高效执行力，参与细胞内错综复杂的生化反应。其中，对小分子的特异性识别与结合能力至关重要，荧光蛋白内部，荧光团被纳米级三维空腔紧紧包裹，这一结构不仅稳固了荧光团的构象，限制了其运动自由度，还显著降低了激发态能量的非辐射耗散，有效避免了荧光团因聚集或短程碰撞而导致的荧光猝灭现象。受荧光蛋白限域效应的启发，我们提出利用蛋白质“俘获”光敏小分子的组装设想，以拓展自组装类荧光蛋白的光化学功能及其在生物医学中的应用。此策略的核心在于，光敏分子的激发态能量弛豫过程深受其基态构象影响，而蛋白质的限域环境为精准调控这一构象提供了可能。为验证这一设想，我们选择血浆中最丰富且无免疫原性的血清白蛋白作为光敏剂小分子的宿主。因其优良的生物相容性和可生物降解性，其已在临床药物递送（如Abraxane）中展现出广泛应用潜力。利用DoGSiteWeb服务器和高斯差分滤波器预测白蛋白结构域表面的潜在结合口袋，并分析口袋的形状、尺寸、体积、表面积和深度等特征。同时在充分理解跨膜运输荧光分子靶向线粒体机制的基础上，结合光功能分子设计理念，确定了与蛋白空间几何互补的直线型吡啶菁光敏分子结构。通过“榫卯”二级组装策略制备了具有肿瘤线粒体靶向的光敏蛋白纳米复合物（PSs@BSAs）。蛋白共晶结果表明了有五种不同构象的PSs结合位点的新结构，揭示了光敏剂光活化结构基础。结合飞秒瞬态吸收光谱及量子力学计算，揭示了蛋白限域调控染料激发态释能途径的分子机制，展示了染料激发态构象动力学参与调控能量分配。通过RNA高通量测序（RNA-seq）获取转录组信息，结果表明，实体肿瘤的光消融与肿瘤血管生成、氧化应激和线粒体代谢（包括有氧糖酵解和氧化磷酸化）的破坏有关。两级组装光敏蛋白工程策略深化了对功能特异性细胞器与药物相互作用的理解，并通过光学、化学、物理、生物学和医学领域的交叉融合，展现出在癌症治疗诊断学的巨大潜力，推进其临床转化进程。

图1. 蛋白限域荧光效应二级组装工程（TASE）策略用于线粒体靶向光动力学治疗示意图

【白蛋白限域双重增强光敏分子荧光与ROS现象】

本研究深入探究了NanoPc（纳米光敏剂）与光敏蛋白复合物在激发态下的能量耗散机制。结果显示，白蛋白作为一种有效的限域介质，能够显著限制光敏剂的扭转构象，进而在保持其光热转换效率（PCE）基本不变的同时，大幅提升荧光量子产率和活性氧（ROS）的生成效率。尤为突出的是，B3@BSA复合物展现出了最高的近红外（NIR）发射增强能力和ROS生成能力，这一特性为近红外显影引导的光动力学治疗（PDT）提供了巨大的潜在应用价值。

图2. 白蛋白限域双重增强光敏分子荧光与ROS

【白蛋白限域激活光敏分子的结构基础】

为探究光敏剂与蛋白的相互作用及激发态结构-功能关系，成功结晶，以2.3Å分辨率解析光敏蛋白复合物晶体结构。结果显示，不对称单元含两白蛋白分子和五光敏剂分子，光敏剂深嵌于白蛋白疏水空腔，形状互补，通过范德华力和静电作用紧密结合。五光敏剂分子构象各异，形成不同能量水平的单个光敏剂，这是复合物强荧光发射和高ROS产生能力的关键。此外，B305桥接界面稳定二聚体结构，每个B3分子精确定位于两蛋白分子界面上。

图3. 白蛋白限域激活光敏分子的结构基础

图4. 共晶中B3的五种不同构象作为“榫卯”点，分别桥接两个白蛋白

【白蛋白限域激活光敏剂的分子机制】

利用瞬态吸收光谱技术探究了B3与B3@BSA的激发态弛豫机制。实验发现，在近红外区，B3和B3@BSA在10 ps和20 ps内迅速演化为ICT发射态，发射中心位于720 nm。B3@BSA展现出独特的第二特征ESA，揭示了其复杂分子构象。飞秒瞬态吸收光谱显示，新激发态在480-550 nm ESA衰减时生成。全局分析揭示B3与B3@BSA分别呈现2个和3个衰变相关分量，对应于S₁、发光态及T₁。结果表明，光敏蛋白中小分子构象调控激发态动力学，强荧光与高效ROS产生源于不同构象光敏剂的功能差异。本研究通过预测血清蛋白结合口袋设计高亲和性光敏分子，实现了通过蛋白调控分子激发态构象动力学来赋予光激活特性，为该领域的发展提供了新思路。

图5. 白蛋白限域激活光敏剂的分子机制

【光敏蛋白复合物线粒体高质量成像与肿瘤特异性靶向】

研究通过共聚焦显微镜与超分辨结构光照明显微镜（SIM）技术，证实了光敏蛋白复合物展现出高效的细胞摄取、快速的线粒体靶向以及线粒体超分辨荧光成像能力，同时表现出优异的光稳定性和线粒体标记高特异性。BALB/c小鼠皮下肿瘤模型实验结果证明了光敏蛋白复合物具有显著的肿瘤靶向和富集能力。

图6. 光敏蛋白复合物线粒体高质量超分辨成像与肿瘤特异性靶向成像

【光敏蛋白复合物PDT治疗效果】

光敏蛋白复合物介导的光动力治疗在荷瘤小鼠中展现出精准可调、高效且低侵袭性的抗肿瘤效果，通过分段药物剂量方案实现了79.5%的肿瘤根除率，显著优于单剂量方案及未经激光照射的对照组。免疫组化染色分析揭示了B3@BSA介导的光动力治疗诱导显著的细胞凋亡与线粒体损伤，同时保持了良好的生物相容性与安全性，为光动力疗法在癌症临床治疗中提供了一种新的药物设计策略。

图7. 光敏蛋白复合物PDT体内治疗效果

【光敏蛋白复合物肿瘤光消融机制】

通过RNA测序（RNA-seq）分析，光敏蛋白复合物介导的光动力治疗在HeLa肿瘤组织中引发了广泛的转录组变化，相较于对照组，显著上调和下调了更多差异表达基因，并通过GO富集分析和KEGG途径富集分析揭示光敏蛋白复合物介导PDT肿瘤治疗与缺氧，破坏血管生成和氧化应激的途径密切相关。PCR 逆转录（RT-PCR）分析也表明了这些基因表达的变化。Western blot分析显示，PARP1下降，cleaved PARP1蛋白升高，证明了肿瘤细胞的凋亡。组织学分析显示B3@BSA介导的PDT治疗显著抑制宫颈癌中血管生成标记物CD31和层粘连蛋白的表达。总之，这些数据表明，B3@BSA介导的PDT治疗可以诱导肿瘤组织严重缺氧，破坏血管形成，引发线粒体代谢和氧化应激危机。

图8. 光敏蛋白复合物肿瘤光消融机制探索

【光敏蛋白复合物PDT介导的线粒体氧化应激与代谢表型变化】

光敏蛋白复合物介导的PDT通过高效生成单线态氧（¹O₂），加剧细胞内缺氧及氧化应激状态，展现出卓越的抗肿瘤效能。同时，光敏蛋白复合物特异性靶向线粒体，通过显著抑制氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解途径，促使HeLa细胞代谢表型向低能量状态转变，从而有效阻断肿瘤细胞的快速代谢适应，干扰肿瘤细胞命运和功能。

图9. 光敏蛋白复合物PDT介导的线粒体氧化应激与代谢表型变化

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122914