施剑林院士团队Science子刊：新兴细胞模拟治疗策略，对抗细胞内病原体感染更有效！

在病原体感染与宿主防御之间的竞争中，传染性微生物可能通过逃避宿主防御机制进入宿主细胞，并使用细胞内的生物分子作为复制的营养。其中，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）依赖宿主细胞保护自己免受抗生素或免疫系统的攻击，以实现在宿主中的长期定植，导致抗生素治疗后的临床治疗失败和复发。在这里，中科院上海硅酸盐研究所施剑林/林翰&上交六院杨闯展示了即使在万古霉素存在的情况下也能生存的细胞内金黄色葡萄球菌，可以通过一种新兴的细胞模拟治疗策略有效消除。这些具有自然杀伤细胞样活性的细胞模拟物（NKMs）由一个氧化还原响应性可降解载体组成，载体内有穿孔素和颗粒酶B。与临床抗生素相比，NKMs在治疗细胞内细菌感染方面表现更为有效，为NK细胞模拟免疫机制在治疗细胞内金黄色葡萄球菌中的应用提供了直接证据。该研究以题为“A natural killer cell mimic against intracellular pathogen infections”的论文发表在《Science Advances》上。

图1展示了自然杀伤细胞模拟物（NKMs）如何有效地杀死感染金黄色葡萄球菌的骨细胞。图中通过透射电子显微镜（TEM）图像显示了NKMs（颗粒）被添加到感染了金黄色葡萄球菌的骨细胞中，随后NKMs发生生物降解，释放穿孔素和颗粒酶B，触发受感染细胞膜的破坏。这一过程模拟了自然杀伤细胞清除细胞内病原体的机制，即通过穿孔素在细胞膜上形成孔洞，使颗粒酶B能够进入细胞内部并杀死细菌。结论是NKMs能够通过模拟自然杀伤细胞的免疫机制，有效地消除细胞内的金黄色葡萄球菌。

图 1.NK细胞模拟物杀死细胞内细菌

【骨细胞内的金黄色葡萄球菌对万古霉素具有抵抗力】

图2探讨了金黄色葡萄球菌在骨细胞内对万古霉素的抗性。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和生物透射电子显微镜（bio-TEM）成像，研究发现即使在万古霉素治疗下，金黄色葡萄球菌仍能在MG63骨细胞的细胞质中定位，并且其数量和结构几乎不受万古霉素影响。流式细胞术和菌落形成单位（CFU）计数的定量分析表明，万古霉素未能杀死藏匿在骨细胞内的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。因此，临床上用于治疗MRSA的标准抗生素万古霉素在杀死细胞内的金黄色葡萄球菌方面是无效的，因为宿主细胞为细菌提供了保护，因此迫切需要替代解决方案。

图 2.骨细胞内的金黄色葡萄球菌对万古霉素具有抵抗力

【金黄色葡萄球菌入侵增加了宿主成骨细胞的细胞表面还原能力】

图3展示了金黄色葡萄球菌感染增强了宿主成骨细胞的细胞表面还原能力，这可能作为治疗细胞内感染的一个有前景的靶点。研究首先通过RNA测序分析发现感染和未感染的MG63成骨细胞在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）途径代谢方面存在显著差异，感染细胞中与NAD合成相关的基因表达上调，而与NAD降解相关的基因表达下调，表明感染细胞中氧化还原代谢活动总体增加。通过WST-1实验和电化学测量，进一步证实了感染MG63成骨细胞表面还原活性增强，以及由于还原物种提供电子导致的工作电极开路电位（OCP）降低和循环伏安（CV）结果中还原峰强度增加。这些结果表明，金黄色葡萄球菌感染的MG63细胞很可能经历了氧化还原物种的某些变化，这些变化可能被用来开发针对细胞内感染的特定抗菌策略，通过设计还原响应性纳米粒子来实现。

图3. 金黄色葡萄球菌入侵增加了宿主成骨细胞的细胞表面还原能力

【NK模拟物的示意图和特性】

图4介绍了自然杀伤细胞模拟物（NKMs）的设计和特性，这些模拟物由负载穿孔素和颗粒酶B的二硫键掺杂的树枝状介孔硅纳米粒子（DMONs）构成，并在DMON表面进行了聚乙二醇（PEG）修饰。这些NKMs在未感染细胞中不表现出直接的细胞毒性，也不会因结构特异性而选择性地靶向这些细胞。然而，一旦与细菌宿主细胞接触，NKMs会被感染细胞高氧化还原电位剪切，迅速释放活性形式的穿孔素和颗粒酶B。实验结果表明，NKMs能够在还原条件下迅速降解，释放出大量的穿孔素和颗粒酶B，这一过程与DMON的降解过程相一致。因此，NKMs的设计使其能够在识别金黄色葡萄球菌感染的MG63细胞后被特异性激活，通过模拟自然杀伤细胞的机制，有效地杀死细胞内的细菌。

图 4.NK模拟物的示意图和特性

【免疫样清除细胞内金黄色葡萄球菌的NK模拟物】

图5展示了自然杀伤细胞模拟物（NKMs）如何通过模拟自然杀伤细胞的免疫机制来消除细胞内的金黄色葡萄球菌。图中通过流式细胞术和细菌菌落计数显示NKMs能显著降低MG63骨细胞内的金黄色葡萄球菌负荷。免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像进一步证实了NKMs在消除细胞内金黄色葡萄球菌方面比其他治疗组更有效。此外，通过生物透射电子显微镜（bio-TEM）和原子力显微镜（AFM）图像观察到NKMs处理后，感染的MG63细胞膜上形成了孔洞，表明NKMs中的穿孔素成功地在细胞膜上打孔，使得颗粒酶B能够进入细胞内部杀死细菌。分子动力学模拟也支持了这一机制，显示了穿孔素在脂质膜上形成孔洞的过程。最后，通过基因集富集分析（GSEA）和细胞因子释放测试，研究发现NKMs能够激活感染骨细胞的免疫反应，增加免疫调节细胞因子的产生，从而启动针对细胞内细菌的宿主免疫反应。因此，NKMs不仅能够直接杀死细胞内的细菌，还能通过诱导非经典的骨细胞免疫原性来增强抗菌免疫反应，证明了NKMs模拟自然杀伤细胞的特性。

图5. 免疫样清除细胞内金黄色葡萄球菌的NK模拟物

【NKMs在小鼠骨髓炎模型中清除细胞内金黄色葡萄球菌并引发抗菌免疫反应】

图6展示了自然杀伤细胞模拟物（NKMs）在小鼠骨髓炎模型中清除细胞内金黄色葡萄球菌并引发抗菌免疫反应的能力。通过体内生物发光成像监测不同治疗方法对小鼠骨髓炎模型中感染进程的影响，结果显示NKMs治疗能显著减轻细菌感染，与其它治疗方法相比具有更好的疗效。组织切片的共聚焦显微镜分析显示，NKMs治疗显著减少了骨细胞内的金黄色葡萄球菌共定位，表明NKMs能有效降低细胞内细菌负荷。透射电子显微镜观察进一步证实了NKMs治疗后细胞内金黄色葡萄球菌残留负荷的显著降低。此外，NKMs治疗还减少了细菌生物膜的形成，证明了其在破坏生物膜方面的潜力。因此，NKMs在体内模型中显示出对金黄色葡萄球菌引起的骨髓炎的高效治疗潜力，不仅能有效清除细胞内的细菌，还能激活宿主的免疫反应，预防感染复发，为治疗难治性骨髓炎提供了新的治疗策略。

图6. NKMs在小鼠骨髓炎模型中清除细胞内金黄色葡萄球菌并引发抗菌免疫反应

【NKMs触发持久的免疫记忆反应以预防感染复发】

图7探讨了自然杀伤细胞模拟物（NKMs）在小鼠模型中触发持久的免疫记忆反应以预防金黄色葡萄球菌感染复发的能力。实验中，经过NKMs治疗的小鼠在初次细菌感染后3个月再次受到挑战，结果显示NKMs治疗显著减少了再次挑战后从植入物和周围组织中回收的活细菌数量。组织学评估显示，与对照组相比，NKMs治疗组的病理参数有所改善，显示出更少的中性粒细胞和细菌浸润。扫描电子显微镜（SEM）观察表明，NKMs治疗能显著扩大效应记忆表型和CD8+效应T细胞亚群，这些细胞能够在细菌再次入侵时清除细菌。因此，NKMs不仅能直接杀死细胞内的细菌，还能通过激活宿主的适应性免疫反应，特别是通过增强细菌特异性的T细胞免疫记忆反应，来预防骨髓炎的复发，从而显示出NKMs在预防感染复发方面的潜力。

图7. NKMs触发持久的免疫记忆反应以预防感染复发

【小结】

该研究开发了一种自然杀伤细胞模拟物（NKMs），能够有效地识别并激活受金黄色葡萄球菌感染的成骨细胞，通过模拟自然杀伤细胞的机制，释放穿孔素和颗粒酶B来杀死细胞内的细菌，同时激发宿主的先天和适应性免疫反应，以消除骨组织中的细胞内细菌。NKMs不仅在体外和体内模型中显示出对万古霉素不敏感的细胞内金黄色葡萄球菌感染的显著治疗效果，而且还能诱导产生细菌特异性的免疫记忆反应，从而预防感染的复发，为治疗和预防骨髓炎等难治性感染提供了一种新的策略。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp3976