前瞻性多中心研究：41种成人实体瘤，RNA-NGS检测融合基因，增加靶药获益几率

精准医学代表了肿瘤学领域的范式转变。基因检测和靶向治疗的可及性常常受到限制。DNA测序可能会遗漏可用药改变。本研究旨在确定RNA检测对患者管理的影响。西班牙国家转化肿瘤学及罕见和孤儿肿瘤研究组（GETTHI）设计了一项多中心前瞻性观察性研究。符合条件的患者为标准治疗后疾病进展的成人实体瘤患者。使用两种RNA检测（Trailblaze Pharos™和Archer FusionPlex Solid Tumor™）对肿瘤样本进行分析。中央委员会评估基因改变的可操作性，并将结果报告给主治医生，由主治医生做出最终的临床管理决策。2016年11月至2019年4月期间，来自30家医院的395例患者被纳入研究，覆盖41种不同的肿瘤。分子分析显示，57例患者（14.4%）存在可操作基因改变。23例患者被建议进行靶向治疗，其中7例患者接受了匹配的靶向治疗，包括2例肺癌患者（分别存在EML4-ALK和CD74-ROS1融合）、3例胶质母细胞瘤患者（EGFR点突变）、1例少突胶质细胞瘤患者（FGFR3-TACC3融合）和1例前列腺癌患者（SND1-BRAF融合）。治疗结局包括2例患者肿瘤缓解、1例患者疾病稳定、1例患者因毒性提前停药、1例患者疾病进展以及1例患者结局未知。尽管我们对癌症生物学的认识不断增加，并且这些认识已转化到药物研发中，但个性化治疗的总体影响仍然较低。能够进行覆盖所有已知可操作基因改变的全面分子检测，以及开展广泛获取靶向治疗的项目，似乎是关键步骤。

研究背景

癌症是一种复杂的疾病，由正常细胞生物学功能失调引起，涉及遗传和非遗传因素。自1991年以来，预防、诊断方面的进展以及靶向治疗和免疫检查点抑制剂等新疗法的开发，使得癌症死亡率稳步下降，总体下降了33%，避免了约380万例癌症死亡。

下一代测序（NGS）技术在癌症基因组研究中的应用具有变革性意义。这项技术不仅揭示了疾病发生和进展的遗传基础，还重新定义了我们的治疗方法和患者管理方式。然而，识别驱动基因改变并将其与乘客事件区分开来仍然是一个重大挑战。针对多种癌症类型的大规模研究对成千上万的肿瘤进行了测序，确定了数百个在癌症中起关键作用的基因和突变。

例如，Bailey等人最近的一项研究分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）的9000多个肿瘤样本，涉及33种不同的组织，一致确定了258个基因的驱动突变。然而，为了为每位患者选择最合适的治疗方法，有必要确定哪些基因改变真正具有可操作性。临床特征相似的患者可能存在分子差异，而具有相似基因改变的肿瘤对治疗的反应也可能不同。

靶向治疗显著提高了某些癌症患者的生存率，如胃肠道间质瘤（GIST）、黑色素瘤和肺癌等。有趣的是，计算研究估计，在广泛考虑生物标志物并提供实验性和跨适应症用药的情况下，高达90%的患者可能从分子指导的治疗中潜在获益。不幸的是，在现实中，患者接受精准医疗的机会仍然较低。

GETHI-XX-16研究由西班牙国家转化肿瘤学及罕见和孤儿肿瘤研究组（GETTHI）发起，旨在确定免费的分子检测项目对临床管理的实际影响。

研究方法

我们设计了一项前瞻性、观察性、多中心研究。患有局部晚期或转移性实体瘤且标准治疗后疾病进展的患者符合入组条件。该项目旨在描述研究检测所覆盖的分子改变的发生率，以及所分析病例的临床和病理特征。此外，最初计划比较接受和未接受匹配靶向治疗（MTT）的患者的结局。

在整个研究过程中，我们采用了两种不同的分子检测策略。2016年11月至2017年5月，最初对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）实体瘤进行TRKA-C、ROS1和ALK免疫组化（IHC）分析。当IHC结果呈阳性时，对FFPE样本进行基于RNA的NGS 检测（Trailblaze Pharos™ Assay，TPA），定性检测NTRK1/2/3、ROS1、ALK或RET基因重排（表1A）。2017年6月至2019年4月，研究方案进行了修订，纳入了Archer FusionPlex Solid Tumor™（AFP）检测，不再需要先前的IHC。该检测识别与各种癌症相关的53个基因的融合和突变（表1B）。

表1

研究结果

本研究有西班牙30家医院参与，这些医院均属于GETTHI小组。总体而言，研究共纳入374例患者，覆盖41种不同的组织学类型，包括中枢神经系统肿瘤（CNS）88例（23.5%）、卵巢癌50例（13.4%）、肺癌31例（8.3%）、前列腺癌22例（5.9%）、膀胱癌、结肠癌和头颈部癌各20例（5.3%）、肾癌16例（4.3%）、乳腺癌14例（3.7%）、黑色素瘤12例（3.2%）和其他≤12例（≤3%）（图1；表2）。在性别分布方面，男性患者占48.9%，女性占49.5%，患者中位年龄为60岁，女性年龄范围为16 - 90岁，男性为21 - 91岁（表2）。

图1

表2

339例患者有肿瘤组织，共获取353份样本，其中原发性肿瘤样本254份（71.9%），转移灶样本97份（27.5%），2份（0.57%）样本来源未知。部分患者提供了多个样本，但均为存档样本，最初是为诊断目的或其他研究而收集的，本研究未专门采集样本。

326份样本（来自316例患者）能够进行分子检测，27份样本因提取的RNA数量少和/或质量低而被排除。肿瘤采集与分子分析之间的中位间隔为11.7个月（范围0.2 - 119.7个月）。在所有样本中，128份（39.3%）使用TPA panel检测，198份（60.7%）使用AFP panel检测 。分子分析发现，66例患者（20.9%）携带一种或多种致病性改变，其中19例使用TPA检出（28.8%），47例使用AFP检出（71.2%）。总体而言，在20个不同基因中检测到71种基因改变，包括28种（39.4%）重排、18种（25.3%）过表达、13种（18.3%）错义突变、11种（15.5%）缺失和1种（1.4%）剪接位点变异（图2、图3；表3）。

图2

图3

表3

在检测到的71种分子改变中，25种（35.2%）被认为可用药，包括EML4-ALK融合（1例患者）、EGFR A289V（5例患者）、EGFR G598V（2例患者）、MET T992I（1例患者）、SND1-BRAF融合（1例患者）、EGFR外显子2-7缺失（9例患者）、MET外显子14缺失（1例患者）、FGFR3-TACC3融合（2例患者）、CD74-ROS1融合（2例患者）和ESR1 E380Q（1例患者）。这些改变中只有1种（CD74-ROS1融合）是通过TPA检测到的。有10例患者被建议进行MTT，最终7例患者接受了MTT（图3）。以下详细介绍这7例患者的情况。

一名携带EML4-ALK融合的肺癌患者接受了阿来替尼治疗，阿来替尼是一种ALK和RET酪氨酸激酶抑制剂，已被美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准用于治疗ALK阳性晚期非小细胞肺癌（NSCLC），适用于克唑替尼治疗后疾病进展或无法耐受克唑替尼的患者。根据RECISTv1.1，该患者在脑部和全身水平均达到影像学部分缓解。

三名携带EGFR突变（两例患者为EGFR-A289V突变，一例患者为EGFR G598V突变）的胶质母细胞瘤患者接受了EGFR抑制剂厄洛替尼治疗。临床前研究表明，厄洛替尼对这两种突变具有活性。所有患者在入组研究前均接受过多线治疗。一名EGFR-A289V突变患者治疗1个月后出现影像学疾病进展。另一名相同突变的患者治疗1个月后因临床状况恶化停用厄洛替尼。携带EGFR G598V突变的患者接受厄洛替尼作为三线治疗，疾病稳定了7个月。

一名肺腺癌患者携带CD74-ROS1融合，接受克唑替尼治疗，但未提供临床结局信息。

一名携带FGFR3-TACC3融合的少突胶质细胞瘤患者参加了一项FGFR3抑制剂福巴替尼（futibatinib，TAS-120）临床试验。然而，该患者在1周后因肝毒性退出治疗。

最后，一名转移性去势抵抗性前列腺癌患者检测到SND1-BRAF重排。该患者还存在c-MET基因外显子14跳跃突变，并且之前在一项临床试验中接受过MET抑制剂治疗，但没有效果。SND1-BRAF融合已在不同肿瘤类型中被发现，导致MAPK通路过度激活和MET抑制剂耐药。建议该患者使用MEK抑制剂曲美替尼治疗，治疗后患者血清学指标明显改善，症状缓解。

由于携带可用药改变且接受MTT的患者数量较少，因此未与其余病例进行比较。

讨论

Gethi XX-16是一项前瞻性研究，旨在确定主要针对基因融合的免费分子检测项目的实际影响。具体而言，我们使用了两个基于RNA分析的panel，它们能够检测NTRK1/2/3、ROS1、ALK和RET基因重排。在研究设计时，这些基因改变已显示出在不同肿瘤类型中广泛分布，并且有可及的靶向药物（已获批或处于临床开发后期）。

最初，我们进行TRKAC蛋白（由NTRK 1、2、3基因编码）、ROS1和ALK IHC预筛查，仅在蛋白过表达的病例中进行TPA检测。不同临床指南认可这种策略，作为一种预先选择对哪些病例进行更深入的分子研究的方法。

随后，采用AFP检测，该检测除了能检测融合外，还能确定另外47个基因中的点突变。由于在这一阶段，这些突变与蛋白过表达不相关，因此我们放弃了IHC预筛查，对所有有样本的病例都进行检测。

在进行测序的316例患者中，66例至少携带一种致病性改变。其中，10种改变（7.6%的测序患者）被认为可用药，包括EML4-ALK融合、EGFR A289V、EGFR G598V、MET T992I、SND1-BRAF融合、EGFR外显子2 - 7缺失、MET外显子14缺失、FGFR3-TACC3融合、CD74 - ROS1融合和ESR1 E380Q。最终，多达7例患者（占总测序患者的2.2%）接受了MTT。

分子检测的成本和时间不断改善，因此已被纳入日常实践。医学中大规模测序技术的引入无疑是近几十年来最伟大的变革之一。不幸的是，分子检测的可及性通常仅限于特定肿瘤，大多数患者没有广泛获得个性化医疗的机会。

此外，这种新范式对医疗专业人员来说是一个真正的挑战。重要的是，具有不同技术特征的各种检测的可及性越来越高，这要求医生、病理学家和遗传科学家详细了解每种检测的优点和局限性。这在确定基因融合时尤其重要，因为某些平台可能会遗漏与未知伴侣的重排。这个问题导致了不同的策略，基于RNA分析的检测通常比基于DNA的panel能更准确和完整地检测，后者只能检测具有预定义序列的改变。

这种技术难题对传统上对肿瘤学融合的重视具有明显影响，所描述的致病性改变的数量与诊断检测的技术改进直接相关。

多项前瞻性和回顾性研究试图评估多基因分子检测对患者临床管理的影响，但结果存在争议。由于使用的检测多样、纳入的患者群体不同，以及可及药物的范围，使得各项研究难以进行比较并得出明确结论。

2015年的SHIVA试验探究了多基因测序的作用，结果显示，与接受非匹配治疗的转移性癌症患者相比，接受MTT的患者预后并未显著改善 。这与其他一些对多基因检测潜在益处持更乐观态度的研究形成对比。

例如，2017年，MOSCATO试验报道，接受MTT的患者中，33%的患者PFS2/PFS1比值大于1.3（PFS2即匹配治疗的PFS，PFS1即既往治疗的PFS），突出了个性化治疗在改善临床管理方面的潜力。同样，2014年至2019年的PERMED-01试验观察到，在使用NGS和阵列比较基因组杂交技术（aCGH）识别基因改变的病例中，36%的患者PFS2/PFS1比值大于1.3 。

2017年，IMPACT研究评估了MD安德森癌症中心精准医学项目的效果。总体而言，纳入的患者中82.1%存在一种或多种分子改变。接受MTT的患者比未接受匹配治疗的患者具有更高的完全和部分缓解率（11% vs 5%）、更长的无失败生存期（FFS，3.4个月 vs 2.9个月）和更长的总生存期（OS，8.4个月 vs 7.3个月） 。

ProFiLER试验纳入了来自四个不同中心的2579例患者，结果未达预期。根据分子特征，为699例受试者推荐了特定治疗方案，但实际上只有163例（6.3%）接受了该治疗。这些患者中有13%达到部分缓解，而在整个队列中，客观缓解率仅为0.9%。

为了提高PFS方面的成功率，采用了多种策略。例如，在WINTHER研究中，转录组分析与DNA测序相结合，显著提高了符合MTT条件的患者比例（未进行转录组分析为23%，进行转录组分析为35%）。

同样，iPREDICT和MAST等其他研究强调了全面分子评估的重要性，即结合基因组和转录组信息，通过个性化治疗策略改善患者预后。iPREDICT研究表明，基于肿瘤DNA/RNA测序和及时建议的联合治疗个性化方案，改善了难治性肿瘤患者的预后。与治疗较少数量的体细胞改变相比，治疗更多识别的分子改变“匹配评分”更高，与疾病控制率、OS和PFS率的显著改善相关。

另一方面，在MAST研究中，32.6%的患者基于RNA NGS融合分析接受了MTT。分子匹配组中PFS2/PFS1≥1.3的患者比例为33%，而对照组中这一比例只有7.9%（p = 0.026）。

我们的研究主要基于融合基因分析，在靶点识别（MTT患者占7.6%）和药物使用（接受治疗的患者占2.2%）方面的比例都特别低。这些结果可能归因于分析基因的范围有限以及专注于融合特异性检测，这些可能是限制因素。此外，需要考虑的是，这些患者患有晚期经治肿瘤，先前治疗诱导的克隆选择可能会影响他们对MTT的反应。其他研究数据表明，整合基因组和转录组分析可显著提高合适的分子靶向治疗的识别率 。

TPA在IHC阳性样本中的变异检出率相对较低（19/128, 14.8%），这一点尤其值得注意，特别是与其他研究形成对比，这些类似分析显示，灵敏度为95 - 100%、特异性为93 - 100%。有趣的是，Murphy等人发现，IHC阳性样本中只有9%的NTRK融合可通过NGS检测到，这与我们的发现更为接近。造成这些差异的一个关键因素似乎是IHC所用抗体的选择。靶向TRKA、TRKB和TRKC C末端结构域的Pan-TRK（EPR17341）抗体显示出高灵敏度（95 - 100%）和特异性（93 - 100%），而TRKA特异性抗体（EP1058Y）的特异性则显著较低，为63%。相比之下，Murphy等人使用了包含靶向Pan-TRK（C17F1，可识别 TRKA、TRKB 和 TRKC）、ROS1（D4D6）和 ALK（D5F3）的单克隆抗体的pan-RTK组合，IHC检测为NTRK阳性的样本中，只有9%通过NGS得到证实。同样，Overbeck等人最近的一项研究报告称，进行Pan - TRK（C17F1）检测的IHC阳性NSCLC样本中，只有1.5%存在NTRK融合 。因此，尽管欧洲肿瘤内科学会（ESMO）推荐两步策略检测NTRK融合 ，但这些观察结果强调了抗体选择在IHC预筛查准确性中的关键作用。

此外，我们的研究具有多中心性质，涵盖了全国30多家医院，与临床试验文献中通常呈现的情况相比，可能更细致、更真实地描绘了临床实际情况。

癌症治疗已从非特异性的细胞毒性药物发展到选择性的基因组和免疫靶向药物，这些药物改变了一些恶性肿瘤的治疗结局。肿瘤的复杂性和异质性提示，癌症治疗的“精准医学”范式需要对个体患者进行个性化治疗。迄今为止，精准肿瘤学试验都是基于与预先确定的单一疗法进行分子匹配。其中一些试验受到匹配率极低的阻碍，匹配率通常在5 - 10%的范围内，且缓解率也较低。匹配率低可能是由于使用的基因panel有限、分子匹配算法严格、药物不可及，或者是晚期患者在治疗实施前病情恶化或死亡。

总之，虽然精准肿瘤学取得了显著进展，但其潜在益处尚未在广泛的患者群体中充分实现。未来的方法应采用综合策略，运用多种DNA和RNA分析平台来识别所有可治疗的分子变异。这种全面的策略将有助于提供定制化治疗，提高肿瘤患者治疗疗效。该方法旨在充分利用基因组学信息，确保靶向治疗更准确地与每位患者独特的肿瘤特征相匹配，最终改善癌症治疗的临床结局。

参考文献：

Navarro P, Beato C, Rodriguez-Moreno JF, Ruiz-Llorente S, Mielgo X, Pineda E, Navarro M, Bruixola G, Grazioso TP, Viudez A, Fuster J, Nogueron E, Mediano MD, Balaña C, Mendez C, Rodriguez RM, Del Barco Berron S, Gongora B, Carmona-Bayonas A, Garcia-Donas J. Prospective study of the real impact of fusion centered genomic assays in patient management in a national collaborative group: the GETHI-XX-16 study. Clin Transl Oncol. 2024 Nov 1. doi: 10.1007/s12094-024-03745-5. Epub ahead of print. PMID: 39485597.