四川大学ACS Nano: 多酚强化的糖萼样水凝胶涂层诱导心肌再生和免疫调节

尽管微创介入封堵器能够有效封闭心脏缺损组织，但仍存在一些限制，包括内皮愈合不良、强烈的炎症反应和血栓形成。在这里，四川大学生物材料国家工程研究中心张博在心脏封堵器上制备了一种多酚强化的药物/肽类糖萼样涂层。该涂层由羧甲基壳聚糖、表儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）、丹参酮IIA磺酸钠（TSS）以及接枝3-氨基苯硼酸的透明质酸组成。随后，通过硫醇-烯“点击”反应接枝了巯基丙酸-GGGGG-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸肽。该涂层表现出良好的亲水性和自由基清除能力，并能够释放EGCG-TSS。生物学实验结果表明，该涂层能够通过促进内皮化来减少血栓形成，并通过对炎症反应的调节来促进心肌修复。调节心肌细胞凋亡和代谢的功能得到了证实，涂层的炎症调节功能主要依赖于NF-κB和TNF信号通路。该研究题为“Polyphenol-Reinforced Glycocalyx-Like Hydrogel Coating Induced Myocardial Regeneration and Immunomodulation”发表在《ACS Nano》

图1详细描述了CETHR涂层的设计和表征过程，包括其结构示意图、组装过程的实时监测、表面特性的综合分析以及功能验证。通过QCM-D实验监测了涂层的动态组装过程，显示出吸附层质量的逐步增加和耗散值的变化，证实了涂层组装的逐步进行和成功形成。表面化学成分通过XPS分析得到确认，AFM结果显示了涂层表面的微观形态和粗糙度，WCA分析表明了涂层改善了材料的亲水性。Zeta电位实验显示了涂层样品的负表面电位，随着pH值的提高，表面电负性增强。DPPH实验验证了CETHR涂层具有出色的自由基清除能力，这归功于其富含抗氧化成分EGCG。此外，CETHR涂层还能够持续释放EGCG-TSS，显示出其在促进内皮化和调节炎症反应方面的潜在功效。因此，CETHR涂层不仅成功制备，而且具备了促进心肌修复和免疫调节所需的关键特性。

图1. CETHR的合成和表征

【血液相容性评估】

图2通过一系列实验评估了CETHR涂层对血液相容性的影响，包括血小板富集血浆（PRP）和全血在样品表面的粘附实验以及体外动静脉分流实验来模拟体内血液流动条件下的抗血栓能力。实验结果表明，与对照组相比，CETHR涂层显著减少了血小板和全血细胞在样品表面的粘附，显示出较低的血液成分粘附密度。此外，通过扫描电子显微镜（SEM）观察到，CETHR涂层在体外动静脉分流实验中减少了血栓的形成和阻塞，表明其具有较好的抗血栓性能。这些结果综合表明，CETHR涂层通过促进内皮化和调节炎症反应，有效降低了血栓形成的风险，提高了材料的血液相容性。

图2. 血液相容性评估

【细胞相容性评价】

图3通过细胞实验和体内植入实验，全面评估了CETHR涂层对细胞行为和组织反应的影响。细胞实验部分，通过FDA染色和CCK-8实验观察到CETHR涂层显著提高了内皮细胞的活性和在涂层表面的粘附，并通过细胞迁移实验发现内皮细胞在CETHR涂层上的迁移距离更长，表明涂层促进了内皮细胞的迁移。同时，对H9c2细胞的实验显示，CETHR涂层不仅增强了细胞活性，还通过提高Cx-43蛋白的表达水平，表明对心肌细胞功能的潜在促进作用。体内植入实验部分，通过在新西兰大白兔颈动脉模型中植入涂层样品，并通过H&E染色和免疫组织化学分析发现，CETHR涂层降低了炎症细胞的浸润，增强了内皮细胞的覆盖，从而促进了内皮化。这些结果综合表明，CETHR涂层具有良好的细胞相容性和促进内皮化的能力，能够有效调节炎症反应。

图3.细胞相容性评价

【皮下植入】

图4通过皮下植入实验评估了CETHR涂层的组织相容性和抗炎性能。实验中，将涂层样品植入Sprague-Dawley大鼠皮下，经过2周和4周后取出植入部位的组织进行H&E染色和免疫荧光染色。结果显示，与对照组相比，CETHR涂层显著减少了纤维囊的厚度，表明其能够降低植入后的纤维化反应。通过CD68和VEGF的免疫染色分析，发现CETHR涂层周围的炎症细胞浸润程度较低，炎症反应较轻，而VEGF表达水平在各组间没有显著差异。这些结果综合表明，CETHR涂层具有良好的组织相容性，能够减少植入后的炎症反应和纤维化。

图4. 皮下植入

【H9c2细胞中基因表达的分析】

图5通过RNA测序分析深入探讨了CETHR涂层对H9c2细胞基因表达的影响。火山图揭示了CETHR涂层处理与对照组之间存在显著差异的基因表达，其中红色和紫色分别表示上调和下调的基因。气泡图和通过KEGG富集分析展示了这些差异表达基因所涉及的生物学途径，其中代表下调途径，而代表上调途径。热图展示了在CETHR涂层作用下表达变化显著的基因，这些基因的绝对倍数变化(|FC|)大于1.2且p值小于0.05。基因相互作用网络通过STRING数据库分析得到，揭示了这些基因之间的潜在联系。热图进一步展示了与CETHR涂层相关的信号通路中差异表达的基因。CETHR涂层通过调节H9c2细胞中的基因表达，在细胞凋亡、代谢、炎症反应等多个生物学过程中发挥了作用。特别是，CETHR涂层能够通过调控与NF-κB和TNF信号通路相关的基因来减少炎症，同时通过影响cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路和MAPK信号通路来抑制H9c2细胞的凋亡。

图5. H9c2细胞中基因表达的分析

【小结】

该研究通过层层自组装技术和硫醇-烯“点击”反应在心脏封堵器上制备的多酚强化药物/肽糖萼样涂层（CETHR），能够清除自由基，促进内皮细胞的粘附和迁移，并对H9c2细胞提供良好的血液相容性和组织相容性保护。此外，CETHR涂层主要通过NF-κB和TNF信号通路发挥其抗炎调节功能，并通过cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、MAPK信号通路和凋亡途径主要调节H9c2细胞的凋亡和代谢。这些结果表明，CETHR涂层通过维持微环境稳态，加速内皮化过程减少血栓风险，并进一步调节炎症以促进心肌组织修复，为心脏封堵器提供了一种有前景的功能涂层。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c06332