揭秘水牛角蛋白的神奇力量：新研究揭示其如何通过双重信号途径缓解氧化应激和炎症

水牛角（WBH）是一种源自水牛科动物水牛角的中药，具有清热解毒、凉血安神的功效，常用于治疗发热、眩晕、皮肤不洁、皮疹、鼻出血、呕吐、痉挛及癫痫等症状。

研究指出，角蛋白是WBH发挥解热作用的关键成分，能够显著减少炎症介质如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）在血浆和下丘脑中的水平，通过抑制氧化应激和花生四烯酸途径来发挥其解热效果。此外，角蛋白中富含硫醇和二硫键的肽组分（SHPF）对于抗炎和抗氧化活性至关重要。这些成分可能是WBH清热解毒作用的活性物质基础。尽管如此，从WBH中提取的角蛋白和SHPF的解热及抗氧化作用的潜在机制仍需进一步研究以明确。

近期，一篇题为“Thiols-rich peptide from water buffalo horn keratin alleviates oxidative stress and inflammation through co-regulating Nrf2/Hmox-1 and NF-κB signaling pathway”的研究文章，深入探讨了WBHK及其衍生的SHPF在治疗氧化应激和炎症方面的潜在效用。

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SHPF对H₂O₂刺激的bEnd.3细胞Nrf2/HOMx-1蛋白表达和SOD1通路的影响

与H₂O₂组相比，SHPF组在上调Nrf2、Hmox-1和SOD1蛋白表达方面表现出明显的剂量依赖性。特别是高剂量SHPF组（50μg/mL），其Nrf2、Hmox-1和SOD1蛋白表达的增加尤为显著（P<0.05，P<0.01）（图2B、C）。因此，SHPF能够激活Nrf2，并在H₂O₂诱导的bEnd.3细胞氧化损伤模型中增加Hmox-1、SOD1的表达，通过Nrf2/HOMx1/SOD1途径调节氧化应激。

研究还采用激光共聚焦显微镜观察了各组bEnd.3细胞中Nrf2（红色标记）与细胞核（蓝色标记）的蛋白表达情况。结果显示，对照组中细胞核的Nrf2阳性表达较少，而在模型组中，Nrf2的红色荧光增强，并部分向细胞核迁移（图2E）。与H₂O₂组相比，SHPF组的Nrf2荧光强度显著增强，核内表达更为突出。这表明H₂O₂能够诱导Nrf2的核转位，而SHPF处理则进一步增强了Nrf2核蛋白的表达。

图2 SHPF对H₂O₂诱导的bEnd.3细胞氧化应激模型和LPS诱导的RAW264.7细胞炎症损伤模型的影响

SHPF对LPS刺激RAW264.7细胞COX-2和15-PGDH蛋白表达的影响

相较于对照组，LPS组中COX-2蛋白的表达显著上升（P<0.001），而15-PGDH蛋白的表达则有所下降（P<0.05）（图2D）。相对地，与LPS组相比，SHPF能够降低COX-2蛋白水平并提升15-PGDH蛋白水平，且这种效应呈现出剂量依赖性。高剂量SHPF组（50μg/mL）效果最为显著，且优于同等剂量的WBHH组。这表明SHPF能够抑制COX-2蛋白的表达，并促进15-PGDH蛋白的表达，从而调节花生四烯酸的代谢途径，缓解炎症反应。

SHPF降低TNF-α刺激的bEnd.3细胞中促炎细胞因子的水平

为评估SHPF的抗炎活性，研究对TNF-α诱导的bEnd.3细胞中促炎细胞因子的浓度及mRNA表达进行了测定。结果显示，TNF-α（100 ng/mL）处理4小时后，上清液中细胞因子水平（包括IL-6、COX-2和PGE2）显著上升（P<0.001）。然而，经SHPF预处理（12.5、25和50μg/mL）12小时后，TNF-α诱导的IL-6、COX-2及PGE2的产生显著受到抑制（P<0.05、P<0.01、P<0.001）。在相同剂量下，SHPF的效果优于WBHH（P<0.05，P<0.001，图3B）。这些结果表明，SHPF能够通过降低关键炎性细胞因子的产生来缓解炎症反应。

为确定SHPF是否能够抑制TNF-α刺激的bEnd.3细胞中促炎细胞因子的表达，研究先用SHPF预处理细胞12小时，随后暴露于100 ng/mL TNF-α4小时。发现SHPF（25μg/mL和50μg/mL）和WBHH（50μg/mL）在TNF-α处理后显著抑制了bEnd.3细胞VCAM-1、ICAM-1、IL-6和MCP-1的表达（P<0.05，图3C）。SHPF处理的细胞中观察到mRNA水平的剂量依赖性降低，其效果较WBHH更为显著。

图3 SHPF对TNF-α诱导的bEnd.3细胞炎症损伤模型的影响

SHPF对TNF-α刺激的bEnd.3细胞Nrf2/HOMx-1和NF-κB通路的影响

Nrf2/HOMx-1途径在减轻炎症反应及预防炎症导致的细胞损伤方面发挥着显著作用。转录因子NF-κB在调控炎症反应过程中扮演着至关重要的角色，研究通过RT-qPCR和WB技术，对Nrf2-HOMx-1以及NF-κB途径相关分子的表达进行了评估。结果显示，SHPF对Hmox-1和Nrf2的蛋白及mRNA表达水平具有剂量依赖性的促进效应。具体而言，高剂量SHPF组（50μg/mL）显著提升了Hmox-1和Nrf2的蛋白及mRNA表达水平（P<0.05，P<0.001）。此外，在使用100ng/mL TNF-α处理后，p-IκB蛋白水平显著增加（p<0.05）。然而，经SHPF（12.5、25和50μg/mL）处理后，此效应得到了逆转，且效果优于WBHH（图3D）。

SHPF对H₂O₂和TNF-α刺激的bEnd.3细胞蛋白质组变化特征的影响

为深入探究H₂O₂、TNF-α和SHPF诱导的bEnd.3细胞蛋白质组的变化，研究者在H₂O₂诱导的bEnd.3细胞氧化损伤模型中，通过无标签定量技术，对照组共鉴定出1661种蛋白质，H₂O₂组鉴定出1621种，而SHPF处理组则鉴定出1719种蛋白质。在TNF-α诱导的bEnd.3细胞炎症损伤模型中，同样采用无标签定量技术，对照组鉴定出1864种蛋白质，TNF-α处理组鉴定出1914种，SHPF处理组鉴定出1835种蛋白质。显著性差异的判定标准为倍数变化（FC）大于1.5以及P值小于0.05。

与对照组相比，H₂O₂组有2种蛋白质显著上调（P<0.05，FC>1.5），同时有10种蛋白质显著下调（P<0.05，FC<0.67）。相较于H₂O₂组（图4A），SHPF组表现出13种蛋白质显著上调（P<0.05，FC>1.5）和2种蛋白质显著下调（P<0.05，FC<0.67）。与对照组相比，TNF-α组有9种蛋白质显著上调（P<0.05，FC>1.5）；而与TNF-α组相比（图4B），SHPF组则有3种蛋白质显著上调（P<0.05，FC>1.5）和7种蛋白质显著下调（P<0.05，FC<0.67）。

图4 SHPF对TNF-α和H₂O₂刺激的bEnd.3细胞蛋白质组变化特征的影响

在TNF-α诱导的bEnd.3细胞炎症模型实验中，TNF-α组的HMGB1呈现活化状态，并且表达量显著增加（P<0.01）。经50μg/mL SHPF处理后，HMGB1蛋白的表达量显著下降（P<0.01，图4F）。进一步观察发现，HMGB1从细胞核向细胞质转移，并最终释放至细胞外。SHPF干预后，细胞核内HMGB1的mRNA水平降低（图4D），而细胞内HMGB1蛋白水平升高（图4E），这表明SHPF能够抑制HMGB1的表达并减少其释放。研究还发现，Hmox-1的表达趋势与WB结果相符，这进一步证实了SHPF能够上调TNF-α和H₂O₂诱导的bEnd.3细胞炎症损伤模型中Homx-1的表达（图4C）。

结论

该研究强调了角蛋白在多个生物活性方面的潜力，深入阐释了其作用机制，这提示角蛋白在开发针对氧化应激和炎症相关症状治疗策略中具有广阔的应用前景。

参考文献：

Wu W, Tang J, Bao W, Feng Q, Zheng J, Hong M, Guo S, Zhu Y, Huang S, Zhao M, Duan JA, Liu R. Thiols-rich peptide from water buffalo horn keratin alleviates oxidative stress and inflammation through co-regulating Nrf2/Hmox-1 and NF-κB signaling pathway. Free Radic Biol Med. 2024 Oct;223:131-143. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2024.07.023