STTT：复旦大学袁正宏/占昌友等合作开发治疗乙型肝炎病毒感染的潜在新策略

2024年6月21日，复旦大学袁正宏、占昌友及上海交通大学付炜共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy发表题为“Optimized RNA interference therapeutics combined with interleukin-2 mRNA for treating hepatitis B virus infection”的研究论文，本研究旨在开发一种针对乙型肝炎病毒（HBV）的泛基因型和多功能小干扰RNA（siRNA），并具有治疗慢性乙型肝炎（CHB）的高效递送系统，并探索RNA干扰（RNAi）和免疫调节的联合方式，以更好地控制病毒。设计并评估了20个靶向分布在整个HBV基因组中的共识基序的合成siRNA，采用HO-PEG2000-DMG脂质，修改LNP处方中传统聚乙二醇(PEG)脂质的摩尔比，优化脂质纳米粒(LNP)处方。在rAAV-HBV1.3 小鼠模型中评估了该制剂递送siHBV（tLNP/siHBV）和小鼠IL-2（mIL-2）mRNA（tLNP/siHBVIL2）的疗效和安全性。

选择基因型覆盖率为 98.55%的siRNA组合，对其进行化学修饰，并将其封装在高效、高安全性的优化 LNP（tLNP）中，以制备CHB治疗制剂。结果显示，tLNP/siHBV显著降低了病毒抗原和DNA的表达，在单剂量或多剂量频率下以剂量和时间依赖性方式进行，具有令人满意的安全性。进一步的研究表明，tLNP/siHBVIL2通过RNA引入有效的 HBsAg 清除并通过表达的mIL-2 蛋白触发强烈的HBV特异性CD4⁺ T和CD8⁺T细胞反应，从而实现病毒的附加抗原和免疫控制。通过采用tLNP作为核酸纳米载体，siHBV和mIL-2 mRNA的共同递送能够协同抗原和免疫控制HBV，从而为治疗CHB提供了一种有前途的转化治疗策略。

乙型肝炎病毒（HBV）感染可导致慢性乙型肝炎（CHB）、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）；然而，治疗选择是有限的。HBV基因组是一个紧凑的3.2 kb环状、部分双链、松弛的环状 DNA（rcDNA）。一旦进入细胞核，rcDNA就会被内源性酶修复成共价闭合环状 DNA（cccDNA），该环状DNA编码四个重叠的开放阅读框 （ORF），包括核心抗原 （HBcAg）、表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和 X 蛋白（HBx）。所有 HBV转录本都具有共同的3'末端，并共享相同的多聚腺苷酸化信号（PAS）。此外，复制能力不全的HBV线性片段可以整合到宿主基因组（intHBV）中，是HBeAg阴性患者HBsAg的主要来源。高循环HBV抗原水平，尤其是HBsAg，有助于免疫耐受和病毒持久性。由于无法完全治愈，因此 CHB 的治疗目标是通过有限疗程的治疗实现 HBsAg 血清清除，即“功能性治愈”。

RNA干扰（RNAi）技术在治疗遗传病和病毒感染疾病方面显示出前景。它也被认为是一种有吸引力的治疗方式，通过诱导抗原抑制、减少病毒血症和 cccDNA 沉默来实现 CHB 的功能性治愈。基于siRNA的疗法还可以缓解高病毒抗原诱导的免疫耐受性，从而有机会通过随后的免疫刺激获得对病毒的免疫控制。然而，考虑到 10 种不同基因型（A到J）之间极高的遗传多样性，设计针对 HBV 等复杂病毒的功能性小干扰 RNA（siRNA）具有挑战性。设计用于靶向 HBV 基因型中保守区域的 siRNA 可以通过计算预测实现，并有望抵抗潜在的病毒突变逃逸，而靶向 cccDNA 衍生转录本共享的常见 3′-末端序列的 siRNA 可能会丢失 intHBV 衍生转录本上的靶标。使用旨在解决 cccDNA和 intHBV 驱动合成的 siRNA 触发器的进一步研究有望在功效和功能方面超过以前的药物。

tLNP/siHBVIL2在rAAV-HBV1.3小鼠模型中的相加抗病毒疗效（图源自Signal Transduction and Targeted Therapy ）

RNAi疗法的临床应用受到与肝脏靶向递送系统相关的挑战的阻碍。凭借新开发的GalNAc（（N-乙酰半乳糖胺）技术和用于肝脏特异性递送的脂质纳米颗粒的优势，基于siRNA的药物，在临床上可用。然而，也存在“PEG困境”。PEG比率影响LNP在体内的性能。尽管PEG的免疫原性较弱，但一定比例的人类可能会产生低水平的PEG特异性抗体，导致聚乙二醇化纳米药物的加速清除和疗效降低。末端聚乙二醇化基团影响PEG的免疫原性，羟基PEG的免疫原性低于甲氧基聚乙二醇。此外，研究小组最近发现羟基-PEG的抗原性比甲氧基-PEG弱。羟基-PEG可以避免人血中预先存在的抗PEG抗体的结合，从而减少补体活化，从而使LNPs逃避抗体识别和快速清除。

虽然RNAi和抗体介导的HBsAg清除可以通过降低病毒负荷来消除免疫功能障碍，但它们不能激活病毒特异性T细胞来实现长期病毒控制。在临床上，只有极少数患者产生抗HBsAg抗体，停药后病毒抗原恢复。最近，临床前和临床研究一直在研究新的联合策略，以实现更好的治疗结果。研究认为，RNAi同时抑制病毒载量和IL-2增强宿主免疫可能足以打破免疫耐受并重建抗病毒免疫。

在本研究中，筛选并化学修饰了一种针对所有形式的 cccDNA 和 intHBV 衍生转录本的泛基因型和多功能siRNA组合（siHBV），并验证了其在多种细胞培养和小鼠模型中的疗效和安全性。利用具有低抗原性和高疗效的优化LNP平台（tLNP）来定义siHBV在控制HBV转录和复制中的作用，并评估其安全性。利用tLNP包封不同形式核酸的可行性，将siHBV和小鼠IL-2（mIL-2）mRNA共递送至单一tLNP制剂中，获得病毒的抗原和免疫控制，研究预计基于tLNP的siHBV和mIL-2 mRNA共递送可能为治疗CHB提供一种可行的方法。

参考消息：

hhttps://doi.org/10.1038/s41392-024-01871-8