山东大学高立芬教授在糖尿病领域取得新进展

糖尿病是由于胰岛素分泌异常和/或功能受损引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，长期代谢紊乱可引起多种严重并发症，是导致患者死亡的重要原因。研究显示，干预胰岛 β 细胞中关键调控分子，可一定程度逆转机体的糖尿病表型，发挥治疗糖尿病的效应^[1]。因此，全面解析 β 细胞稳态调控的分子机制，明确关键调控因子，将为有效干预糖尿病提供新的策略，具有重要理论研究价值及潜在临床应用前景。

2024年2月9日，山东大学齐鲁医学部基础医学院高立芬教授在《Advanced science》杂志在线发表了题为“Beta-Cell Tipe1 Orchestrates Insulin Secretion and Cell Proliferation by Promoting G𝜶s/cAMP Signaling via USP5”的研究成果。该研究揭示了肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子 1（Tipe1）分子调控β细胞稳态抑制糖尿病进展的新机制，可作为糖尿病治疗的潜在靶点。

在本研究中，研究人员通过免疫组化、多色免疫荧光及qRT-PCR等技术检测Tipe1在胰岛中的表达情况，结果显示，Tipe1在胰岛β细胞中高表达（图1），提示Tipe1可能参与调控胰岛 β 细胞功能。为了明确胰岛β细胞中高表达的Tipe1是否参与糖尿病进展，构建了Ins2-Cre驱动的胰岛 β 细胞条件性敲除 Tipe1 的 db/db 小鼠，表型分析发现Ins2-Tipe1BKO-db/db 小鼠体重增加缓慢，且体型显著小于对照 Ins2-Cre-db/db 小鼠。进一步检测糖尿病相关指标，发现Ins2-Tipe1BKO-db/db 小鼠的血糖升高、胰岛素水平显著降低，且 Ins2-Tipe1BKO-db/db 小鼠糖耐量严重受损（图2）。以上结果表明，Tipe1敲除加重 db/db 小鼠血糖紊乱，导致严重的糖尿病表型。

图1. Tipe1高表达于胰岛β细胞

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

图2. Ins2-Tipe1BKO-db/db 小鼠血糖紊乱

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

为探究 Tipe1对 β 细胞的调控作用，利用离体的小鼠胰岛以及 MIN6 细胞系，通过Western blotting 、qRT-PCR、流式细胞术和免疫荧光等技术检测 β 细胞的增殖、凋亡及胰岛素分泌功能。结果显示，Tipe1缺失抑制β细胞增殖和胰岛素分泌（图3）。

为阐明 Tipe1 调节胰岛 β 细胞功能的分子机制，在 MIN6 细胞中过表达Tipe1，进行免疫沉淀和质谱检测。通过分析质谱结果，发现了 β 细胞中大量潜在的 Tipe1 相互作用蛋白。将 Tipe1 潜在互作蛋白与已报道的在糖耐量受损和 2型糖尿病患者胰岛中差异表达的基因做聚类分析，通过对已报道的基因功能进行筛选，将Gαs（由 Gnas 编码）和 GASP1（由 Gprasp1 编码）初步定为 参与Tipe1 调控β细胞功能的互作蛋白（图4A）。进一步检测发现Gαs 介导了Tipe1对β细胞的调控（图4B-I）。文献显示，Gαs/cAMP 通路在调控胰岛 β 细胞功能中具有重要作用^{[2, 3]}，cAMP 可促进胰岛素的生物合成、胰岛素分泌和 β 细胞质量。在本研究中，通过 ELISA 检测cAMP 的水平，结果显示，cAMP 在 Tipe1 过表达的 MIN6 细胞中显著上调，在 Gnas敲减后则被逆转（图 4J），且cAMP激动剂处理逆转了 Gnas 干扰导致的 Tipe1 过表达组的胰岛素、增殖关键基因的表达下调，p-PKA、p-CREB 和 p-AMPK 的表达也被逆转（图 4K-N）。以上结果证实， Tipe1 通过 Gαs/cAMP 通路调控胰岛 β 细胞功能。

图3.Tipe1缺失抑制胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

图4. Tipe1通过Gαs/cAMP调控胰岛β细胞功能

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

为明确Tipe1调控Gαs的具体机制，通过qRT-PCR、Western blotting和IF检测，结果显示，Tipe1缺失降低了Gαs蛋白水平，但其转录水平无明显变化，提示Tipe1通过蛋白翻译后修饰调控Gas蛋白水平的表达。通过加入放线菌酮（CHX）处理敲低Tipe1的HEK293T细胞，结果显示，Tipe1敲低缩短了Gαs蛋白半衰期。进一步加入自噬抑制剂氯喹（CQ）和蛋白酶体抑制剂（MG132）处HEK293T细胞，结果表明，Tipe1通过蛋白酶体途径抑制Gαs蛋白降解（图5F，G）。为阐明 Tipe1 抑制 Gαs 蛋白降解的潜在分子机制，将质谱分析得到的 Tipe1互作蛋白进行 Gene Ontology（GO）分析。结果显示，Tipe1 互作蛋白参与了 RNA 剪接、蛋白质转运和蛋白泛素化过程等（图5H）。文献显示，Tipe1 可抑制其互作蛋白的多泛素化^[4]。通过Western blotting检测Tipe1对 Gαs蛋白泛素化的影响，结果显示 ，Tipe1 过表达抑制了Gαs K48位的泛素化（图5I-L）。以上结果表明，Tipe1通过抑制Gαs蛋白K48位泛素化修饰，从而稳定Gαs蛋白。

为进一步阐明 Tipe1 调控 Gαs 蛋白泛素化降解的具体分子机制，分析 Tipe1 互作蛋白的 GO分析数据，富集到数个泛素化相关的蛋白，利用 IP 实验进一步筛选，证实去泛素化酶 USP5 参与 Tipe1 对 Gαs 蛋白泛素化的抑制（图6）。最后，对人胰岛组织临床标本的多重免疫荧光染色显示，Tipe1、Gαs 和 USP5 存在共表达，且Tipe1 阳性的胰岛 β 细胞中具有更高比例的 Gαs 和 USP5 双阳性细胞和更高比例的 Gαs 蛋白表达。更重要的是，2型糖尿病患者胰岛 β 细胞中 Tipe1 和 Gαs 双阳性细胞比例显著降低（图7）。以上结果表明，Tipe1通过去泛素化酶USP5稳定Gαs 蛋白。

图5. Tipe1与Gαs互作并抑制其K48位泛素化修饰

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

图6. Tipe1通过USP5抑制Gαs蛋白 K48位泛素化修饰

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

图7. 人胰岛 β 细胞中 TIPE1、Gαs 和 和 USP5共表达

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

图8. Tipe1通过 USP5 促进 Gαs/cAMP 信号调控 β 细胞稳态的模式图

（图源：Ding et al., Advanced science. 2024）

【文章结论与讨论，启发与展望】

本研究通过细胞模型、动物实验及临床标本检测，将 Tipe1鉴定为维持胰岛β 细胞功能稳态的关键调控分子，并揭示了其抑制 T2DM 进展的新型生物学功能及其作用机制。在生理状态下，胰岛 β 细胞缺乏 Tipe1导致糖尿病前期表型，包括葡萄糖耐受不良和胰岛素分泌受损。在糖尿病条件下，胰岛 β 细胞敲除 Tipe1显著加重糖尿病表型。通过 IP/质谱分析，β 细胞中存在大量潜在的 Tipe1 相互作用分子，包括 β 细胞调节因子Gαs。进一步发现 Tipe1 通过降低 Gαs 泛素化水平促进 Gαs 蛋白稳定性，增强下游cAMP 信号通路，进而促进 β 细胞增殖及胰岛素分泌功能。在机制研究中，通过分析质谱结果，筛选到与 Tipe1 互作的去泛素化酶 USP5，明确了 Tipe1 通过 USP5 抑制 Gαs蛋白 K48 位泛素化修饰调控 β 细胞稳态的作用机制（图8）。文献显示，由于缺乏 Gαs 的表达，导致 GLP-1R 的下游信号缺失，GLP-1 类似物难以维持 β 细胞的功能^[5] 。GLP-1R 通过增加细胞中 cAMP 的产生，促进胰岛素分泌，进一步强调了 Gαs 的重要作用^[6]。本研究将为糖尿病干预提供新的候选靶点，并有望为提高 GLP-1RA 治疗糖尿病的响应性提供新思路。

山东大学基础医学院高立芬教授为该论文通讯作者，基础医学院博士研究生丁璐为该论文第一作者，山东大学为该论文的第一作者单位和通讯作者单位。本研究得到国家自然科学基金、科技部重点研发计划、山东省自然科学基金等项目及山东大学青年交叉团队的资助。

参考文献

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