ADC非临床安全性评价的考量因素

前言

抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成,兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。

关于肿瘤学的ADC药物非临床安全性评估的多种策略已有描述。然而，ADC的复杂性使其非临床安全性评价必须基于该药物的具体情况，同时依赖于相关指南的应用和与监管机构的密切协商。ADC毒性的关键决定因素除了靶向抗原选择和有效载荷的作用机制外，还包括连接子和偶联技术与位点的选择。

安全性评估的策略应充分考虑ADC每个组分的可用信息。许多已批准或正在开发的用于肿瘤适应症的ADC使用相同的单克隆抗体或细胞毒性药物，已经产生大量的非临床和临床数据，充分利用这些使用相同连接子和小分子毒性药物的ADC的可用信息非常重要。然而，安全性评估不仅应考虑单个组分的可参考信息，而且还应考虑在特定ADC的组合中而导致的毒性特征的可能差异，例如发生变化的药代动力学和组织分布相关的差异。将毒性药物与抗体偶联可改变任一组分的活性或赋予可显著影响安全性的独特性质，因此，临床上最相关的毒性数据通常来自于完整ADC的研究。

动物实验物种的相关性

为了使非临床安全性研究能够充分地表征ADC的毒性以支持临床开发，评估动物试验物种的相关性和非临床结果的可用性是至关重要的。这些通常需要检测ADC抗体与动物实验物种中靶抗原的亲和力，以及免疫组织化学染色观察交叉反应。此外，还应考虑ADC其他成分相关的物种差异，例如与小分子相关的的药理学或连接子稳定性相关的物种差异。与其他药物和生物制品一样，还应包括对暴露参数和代谢的比较。

BR-96 doxorubicin，是一种靶向Lewis-Y抗原的嵌合抗体与doxorubicin偶联的ADC药物，在早期非临床的毒理学研究中，发现狗与大鼠和猴子不同，对ADC的毒性作用敏感，并经历了出血性肠炎作为剂量限制毒性。研究表明，BR96–DOX和未偶联的抗体具有相同的剂量限制毒性，表明毒性是由抗体介导的，胃肠活检显示抗体与上皮细胞结合并致其受损，可能是由补体激活所致。因此，在人的BR96 Dox第I期临床试验中，剂量选择基于狗的非临床观察，因为狗和人类一样，都在胃肠道上皮细胞中表达Ley抗原。

临床研究中在乳腺癌患者比较了BR96-DOX与doxorubicin的药效和安全性，ADC的疗效较低，两组间毒性差异显著。服用BR96-DOX与doxorubicin的典型副作用不相关，但会产生胃肠毒性，包括恶心、呕吐、胃溃疡和出血，这些都出现在狗的非临床研究中。据报道，一名接受BR96单抗的患者与接受相应剂量ADC的患者一样显示胃肠毒性，与狗体内的毒理学数据一致。胃肠毒性被认为是该药物与表达靶抗原的正常组织结合的表现，这可能损害了ADC到肿瘤部位的传递。因此，开发在癌症治疗中靶向Lewis抗原的药物应努力减少与正常组织的交叉反应。  

上述案例表明，确定一个合适的试验物种对于预测在人类中的毒性至关重要，它有助于阐明细胞毒素药物通过抗体偶联后的非特异靶向，毒性分布的差异，以及阐明毒性驱动因素，从而指导ADC的临床开发。

抗体靶标的表达

与治疗性单克隆抗体的情况一样，动物试验物种中缺乏抗原靶点可能会阻碍ADC的非临床评估。ICH S6（R1）《生物技术衍生药物临床前安全性评价指南》（2011年）指出，“含有新毒素的抗体-药物/毒素偶联物（ADC）的物种选择应遵循与非偶联抗体相同的一般原则。。。用于测试单克隆抗体的相关动物物种是那些表达所需表位并表现出与人类组织相似的组织交叉反应谱的物种。” 因此，物种和疾病特异性可能决定或限制非临床评估。

Polatuzumab vedotin是一种靶向人B细胞上CD79b的ADC，但临床前研究发现其与小鼠、大鼠或食蟹猴的CD79b都不结合，导致缺乏与药理学相关的非临床物种。使用与食蟹猴CD79b结合的替代ADC进行非临床毒性研究，这是ICH S6（R1）指南中描述的生物制剂非临床安全性评估的另一种方法，该替代ADC在人CD79b的亲和力类似于polatuzumab vedotin。

替代ADC使用与polatuzumab vedotin相同的连接子-有效载荷，并且具有相似的药物抗体比（DAR），但是替代抗体不同于临床抗体，它是一种具有非人源化的嵌合抗体。临床前研究需要对替代ADC进行充分表征（包括结合表位、活性和效价以及PK），此外还需要提供对应的polatuzumab vedotin的相关药理学、PK和安全性信息。

药物和/或抗体的生物活性

尽管ADC包含几种组分，但在大多数情况下，肿瘤适应症ADCs的非临床和临床研究中观察到的严重或剂量限制毒性主要是由细胞毒药物和/或其代谢产物所介导的。例如，周围神经病变发生在许多使用微管抑制剂的ADC中，最突出的是MMAE。另外，眼部毒性通常由包含DM4和MMAF的ADC引起。

FDA对所有申报的肿瘤ADC非临床安全数据的分析发现，ADC对啮齿动物和食蟹猴的毒性主要见于造血系统、肝脏和生殖器官。如果有效载荷、连接子、DAR和给药频率一样，无论抗体靶标或亚型如何，在人体的最大耐受剂量（MTDs）都是相似的。这一点在已获批的4种ADC在大鼠和食蟹猴的临床前研究中观察到毒性重叠现象一致。         

在这些ADC的非临床研究中观察到的毒性通常与MMAE或MMAF的预期活性一致。enfortumab vedotin非临床和临床研究中观察到的皮肤和眼睛毒性被认为可能是由Nectin-4的靶向介导，另外，belantamab-mafodotin的眼部毒性与其他MMAF偶联ADC一致，MMAF引起的相关炎症反应可能是导致动物眼睛毒性效应的原因。

此外，在无物种交叉反应的大鼠试验中细胞毒素相关毒性比有交叉反应的猴子试验中更明显，这表明高水平表达的靶标可能延缓药物相关毒性的出现。最近FDA对含吡咯苯并二氮杂卓（PBD），DAR为2的ADC数据进行了分析，发现动物和人表现出的毒性主要是由毒素药物引起的，通过抗体靶点介导的作用不明显，与之前的结论一致。

ADC脱靶相关毒性的机制目前尚不清楚，但除了连接子-有效载荷不稳定导致过早释放外，还可能通过Fc介导和非特异性内吞引起完整ADC的抗原非依赖性摄取。在ADC相关眼部毒性的研究中，评估了一系列靶向ENPP3的ADC，其中含有mc-MMAF或vc-MMAE。研究结果发现，微胞饮作用在人角膜上皮细胞（HCEC）对ADC的内化过程中起着重要作用，这一过程至少部分依赖于ADC的生物物理性质（电荷和疏水性）。有趣的是，与vc-MMAE（AGS-16C3E）偶联的单抗和与mc-MMAF（AGS-16C3F）偶联的单抗在HCECs中具有相似的细胞毒性，这表明试验中的效果与这两种连接子-有效载荷类型无关。

另一种ADC，抗RET单抗（Y078）偶联DM1的毒理研究则强调了所有ADC组分的重要性。Y078以相似的亲和力与人和食蟹猴的RET结合，组织交叉反应也显示相似的染色模式，表明猴子是评估靶向效应的合适试验物种。毒性研究发现，Y078-DM1和未偶联的Y078在较小程度上与剂量依赖性周围神经病变有关。由于RET在成人外周神经系统中表达，这是一种预期的结果，即将有效的微管干扰药物靶向表达RET的细胞。然而，在未偶联的Y078中也观察到神经毒性表明，除了靶向给药外，抗体也具有一定的作用。

MEDI-547，一种由靶向EphA2的抗体与MMAF偶联的ADC，抗体部分与人类、食蟹猴、小鼠和大鼠EphA2具有相似的亲和力。然而，尽管在1期研究中报告的患者凝血异常与非临床研究中发现的所有三个物种的凝血异常相似，但人类发生严重血液毒性的剂量远低于基于非临床研究预测的安全剂量，导致临床研究中止。根据药代动力学数据显示，ADC的有效载荷基本没有发生脱离，因此，抗体可能是研究中观察到的毒性的原因。

连接子化学

连接子是ADCs安全性和有效性的重要决定因素。连接子通常分为可切割型和不可切割型，其设计可在血流中保持稳定，同时允许小分子细胞毒素在靶细胞内吞后有效释放。

连接子在体循环中的稳定性一直是安全性评估的一个关键焦点，因为在ADC的靶细胞内化之前，小分子的过早丢失可能导致非特异性药物释放的靶外毒性。开发具有更稳定连接子并保持更低水平非偶联单抗，被认为是改善ADC药代动力学特性、治疗指标和安全性的关键。

Mylotarg的一个很大的问题就是不够稳定的连接子，但通过优化，后续的ADC如inotuzumab ozogamicin和milatuzumab doxorubicin使用类似的不耐酸的腙连接子，在人血浆和血清中显示出良好的稳定性。然而，将含有腙连接子的ADC与使用蛋白酶敏感的二肽连接子的ADC进行比较表明，肽连接的ADC在缓冲液和血浆中比相应的腙连接物更稳定，因此表现出更特异的传递和更低的全身毒性。

连接子-有效载荷稳定性的物种差异使在非临床研究的基础上评估ADC的治疗指数变得困难。在小鼠中观察到的酶促VC-PABC裂解，与在大鼠和食蟹猴血浆中检测到的稳定性形成对比，这种差异归因于羧酸酯酶活性和底物特异性的物种差异。

连接子也会影响ADC的物理化学性质，如聚集趋势，这会影响ADC的疗效、肝毒性和免疫原性。在使用喜树碱细胞毒素的ADC的开发过程中，将基于葡萄糖醛酸的连接子与二肽连接子进行比较时，亲水性更强的葡萄糖醛酸连接子比二肽连接体子产生更少的抗体聚集。该研究还报道抗Lewis-Y抗原的二肽连接子喜树碱ADC对小鼠模型中的肿瘤生长没有影响，而相应的葡萄糖醛酸连接子ADC诱导了实质性的肿瘤生长延迟。

小结

非临床毒理学研究的目标是预测在临床中潜在的安全风险。ADC非临床安全性研究的预测价值可以通过适当选择动物试验物种、了解产生不良反应的机制或ADC的毒性驱动因素来提高。

肿瘤适应症ADC临床开发过程中报告的非临床和临床毒性结果表明，ADC的每个组分都可能在观察到的毒性反应中发挥作用，因此，在设计和解释非临床安全性研究时应予以考虑。尽管在大多数情况下，严重或剂量限制性毒性似乎主要由小分子介导，但随着ADC领域的发展和扩大，可能会出现不同的模式。

参考文献：

1. Considerations for theNonclinical Safety Evaluation of Antibody–Drug Conjugates. Antibodies (Basel). 2021Jun; 10(2): 15.