【衡道丨干货】病理技术——淋巴结组织冷冻切片技术分享

在术中对淋巴结进行冷冻切片检查，可以在短时间内确定手术范围，及时更改手术方案。但淋巴结通常被脂肪包裹，或本身脂肪化，同时多枚送检，加上制片时间限制，可能会导致冷冻制片质量参差不齐，甚至难以制片。淋巴结组织冷冻切片后，诊断医生要在淋巴细胞群中寻找肿瘤细胞，如果制片质量不佳，则很容易出现漏诊或误诊，因此，淋巴结冷冻切片的重切率在很多病理科高居榜首。

 一、取材

通过手指触摸脂肪中较硬的结节，淋巴结手感为光滑圆形或者椭圆形，轻压易活动，剔除周围脂肪，暴露整个淋巴结。此步骤基本由取材医师完成，技术老师应提醒取材医师淋巴结取材注意事宜。

注意事项：

1、一定要保证取材台，取材刀和纱布是干燥的，减少人为带入水分，标本下最好垫上吸水纸，吸水纸可吸去部分脂肪，及时擦去手套上粘的脂肪，以免影响取材。

2、尽可能剔除淋巴结周围脂肪，不要破坏淋巴结被膜。

3、最大径大于5mm的淋巴结要对剖取材，对剖尽可能沿长轴对剖，暴露淋巴结的最大面。

4、淋巴结直径大于2cm时，需要按书页状切开取材。

5、每个冻头尽可能不超过3枚淋巴结。

6、淋巴结送检通常是多枚同时送检，取材时要注意区分部位。

多枚淋巴结同时送检

 二、包埋

高质量包埋是决定淋巴结冷冻切片的关键。

通常滴加少许OCT于冷冻头上，轻轻放上淋巴结组织，待淋巴结四周包埋剂变白（冷冻完成）后使用冷冻锤轻压在组织表面，加速冷冻。对于淋巴结较小或者一个冻头包含数枚淋巴结时，要合理使用“冰垫”，即提前滴适量OCT部分冷冻，再将组织放在OCT上。多枚淋巴结包埋于一个冷冻头时，要沿着淋巴结长轴平行包埋，形同“川”字包埋。淋巴结常常是多枚统一送检，根据个人切片速度，包埋合适数量的冷冻头，冷冻太久会对细胞核造成不可逆的影响。个人经验，先冻两个，切完再冻两个，即切二冻二。

注意事项：

1.淋巴结包埋，要注意用OCT完全包裹淋巴结。

2.添加OCT时需要轻柔，避免反复挤压，空气倒流，胶内产生小气泡。

3.同一份标本，淋巴结大小或厚度不一致时，大的厚的先包埋，小的薄的后包埋。

冰垫

挤胶时形成气泡，需要及时用镊子刺破

 三、切片与贴片

淋巴结组织由于细胞致密，纤维较少，切片时易有裂隙或发脆，切片时下刀要匀速、缓慢，贴片时要自然，尽量不要牵拉。

温度：通常组织的切片温度为-20℃，淋巴结宜稍高2-3℃。

厚度：4-6μm，切片机机箱的温度和切片手法对厚度影响较大，温度恒定，转速均匀，每张切片的厚度差别不大。

注：

在不同切面各取一张切片，即需要深切后再取一张切片，以减少漏诊，这一步很关键。

常见淋巴结类型分为如下五种：

边缘型、中央型、完全型、不对称型和多枚型。

1、边缘型（淋巴结和脂肪组织各在一边），这种是最常见的类型，淋巴结脂肪化的后果。切片只需要沿着淋巴结的长轴切片，一般可以获得质量较高的切片。

边缘型

2、中央型（淋巴结四周被脂肪包裹或淋巴结包裹脂肪），这种淋巴结往往切片难度较大，需要一定的技巧，否则易卷曲或折叠。文献报道的有抠出脂肪补胶法，挤压法，搭桥法等多种方法，无论哪种方法都是为了减少脂肪的干扰。我常用的是粘附法，方便快捷，无需额外操作。脂肪组织在-20℃时，仍然较软，却具有一定的粘附性，只需要缓慢转动手柄，用毛笔轻轻压住切片，保持不动，不可边切边牵拉，切脂肪时，脂肪在刀口少量残留，切淋巴结时，利用脂肪粘附性将淋巴结两边粘附在OCT上，再轻轻展开，贴片即可。

中央型

中央型切片手法

3、完全型（淋巴结周围无脂肪组织），这种常见于肺淋巴结和颈部淋巴结，送检淋巴结周围脂肪组织较少，容易寻找和脂肪易剔除，切片难度不大。

完全型

4、不对称型（淋巴结对剖之后，一半是淋巴结大部分，一半是淋巴结小部分或无淋巴结）这种淋巴结也十分常见。切片只需要关注淋巴结部分即可，切片易形成褶皱，可采用吸水纸挤压法，粗修暴露脂肪和淋巴结，用吸水纸轻轻挤压脂肪，使脂肪凹陷，切片时即可跳过脂肪，形成完整切片。

不对称型

5、多枚型（同一块组织中有两枚或以上淋巴结）这种比较少见，取材时，几枚淋巴结十分靠近，无法区分。切片时要平行切或者调整淋巴结的上缘在同一水平线，也可以参考中央型淋巴结的切片方法，能切出较理想的切片。

多枚型

 四、固定

淋巴结中淋巴细胞密集排列，缺少纤维结缔组织，淋巴细胞缺少细胞质的保护，极易受到环境的影响，因此淋巴结一定要贴片后立即浸泡固定。固定的好坏直接影响染色质量，单纯固定液固定不少于1min，混合固定液固定不少于15s。冷固定和常温固定差别不明显，但常温固定试剂易挥发，浓度不可控，工作量较大的实验室推荐冷固定。常用的固定液有甲醇、95%乙醇和一些混合固定液(如乙醚酒精，AAF液等)。固定液大部分是透明液体，固定液浓度至关重要，要勤更换。日常工作中，混合固定液固定速度和效果普遍优于单纯固定液，尤其可缩短固定时间。但是混合固定液通常保存时间较短，各原材料的浓度会影响固定效果。

固定不佳。

左图为固定不及时，染色对比度差，细核呈灰蓝色；右图为甲醇固定30s，细胞核肿胀

固定较好。

左图为甲醇固定1min；右图为AAF液固定15s

 五、染色

淋巴结切片染色通常不必单独设置染色程序，但推荐增加分化步骤，部分实验室为了追求染色时间短，有可能省略分化步骤，在淋巴结切片中分化能让细胞核染色更透亮，核内颗粒更清晰，有助于诊断。

分化前

分化后

 六、淋巴结切片中常见问题

1、冰晶：冰晶是不可避免的，微小冰晶不影响组织细胞形态。

注：大冰晶破坏组织结构

2、不同程度掉片：

3、漏诊：

切片不完整是导致漏诊的主要原因

4、贴片牵拉：

5、卷曲：

6、染色不佳：

淋巴结最常见的染色不佳是伊红着色浅

7、包埋切片原因：

包埋不紧凑和切片角度选择错误导致切片质量不佳

8、裂隙：

裂隙一般是由冷冻温度过低导致，也可见于切片速度过快

参考文献：

1.保乳标本乳腺切缘及前哨淋巴结的冷冻制片专家共识[J].临床与实验病理学杂志,2023,39(3):257-260.

2.张盛,王明伟,杨家莉,高少阳.介绍一种乳腺癌"孤岛"型前哨淋巴结冷冻制片方法[J].诊断病理学杂志,2023,30(10):1038,1042.DOI:10.3969/j.issn.1007-8096.2023.10.032.

3.刘菲菲,李雪.冷冻组织不同贴片方法对乳腺癌前哨淋巴结活检诊断的影响[J].诊断病理学杂志,2023,30(1):6-9,13.DOI:10.3969/j.issn.1007-8096.2023.01.002.