【综述】环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1信号通路在脑缺血-再灌注损伤发病机制中的研究进展

摘要:脑缺血-再灌注损伤(CIRI)是缺血性卒中患者恢复患侧脑组织血流时引发的严重并发症｡CIRI患者常伴有神经功能减退､认知障碍､情绪障碍等,对日常生活产生严重影响｡目前CIRI易被早期诊断,但相关特异性治疗方法相对较少｡作者对环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1(Epac1/Rap1)信号通路与CIRI的相关性研究进行综述,以期为CIRI患者的临床治疗提供新思路｡

卒中分为缺血性卒中和出血性卒中,其中缺血性卒中更为常见,占卒中总体发生率的85%｡临床中治疗缺血性卒中的主要方法为机械取栓或使用重组组织型纤溶酶原激活剂进行溶栓,及时恢复缺血脑组织的血流灌注｡当患侧脑组织血运重建时,可能引起病变脑组织发生炎症､坏死等继发性损伤,即脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia- reperfusion  injury, CIRI)｡CIRI可造成脑功能严重损伤,导致患者出现认知功能障碍､神经功能受损和抑郁情绪等｡CIRI涉及多种发病机制,如血-脑屏障破坏､炎症反应和细胞凋亡等｡有研究表明,CIRI发生后有多种信号通路发挥着不同的作用,如Wnt蛋白/β-连环素信号通路､核因子κB信号通路､环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号通路､裂原活化蛋白激酶信号通路等｡近期有研究显示,调控环腺苷酸激活交换蛋白(exchange protein directly  activated by cyclic adenosine  monophosphate, Epac)1/RAS相关蛋白1(Ras-proximate-1,Rap1)信号通路与CIRI发病机制密切相关｡笔者对Epac1/Rap1信号通路与CIRI的相关性研究进行综述,以期为临床治疗CIRI提供新思路｡

1 CIRI发病机制

缺血性卒中主要由颅内血管狭窄或闭塞所致,从而引发脑内细胞凋亡或坏死､神经血管单位改变等一系列脑损伤｡临床中多采用恢复患侧脑组织血运的方法对缺血性卒中进行治疗,由此引发的继发性损伤即为CIRI｡CIRI分为缺血性损伤和再灌注损伤两部分｡缺血性损伤主要由脑组织血液循环障碍引起的细胞缺氧和营养不足所致;长时间缺血后,细胞代谢产物积存,导致代谢性酸中毒｡一旦血液再次灌注,白细胞便聚集黏附内皮细胞,还可穿透血管内皮向脑组织浸润,由此引发局部组织炎症反应,增加活性氧的含量,进一步加重脑组织的损伤｡随着CIRI时间增加,相关额叶组织出现神经递质性氨基酸代谢紊乱,如谷氨酸､天冬氨酸等兴奋性氨基酸水平随再灌注时间的增加而降低,而丙氨酸､γ-氨基丁酸､牛磺酸和甘氨酸等抑制性氨基酸水平随再灌注时间的增加而升高,可导致患者出现抑郁情绪和认知功能障碍｡此外,随着CIRI时间增加,脑组织超微结构发生改变,如核染色质凝集､内质网高度肿胀､神经细胞破坏,继而脑组织间隙可出现大量水肿液和脑白质疏松等不可逆损伤｡因此,防治缺血性卒中患者发生CIRI已成为临床上亟待解决的问题｡

2 Epac1/Rap1信号通路

环磷酸腺苷(cyclic adenosine  monophosphate, cAMP)作为一种重要的细胞内第二信使,广泛存在于多种体液和生物细胞中｡多项研究表明,cAMP主要通过激活蛋白激酶A发挥作用,在多种疾病的发病机制中发挥重要作用｡但有研究显示,蛋白激酶A并非cAMP唯一的靶分子｡1998年,De Rooij等为证明cAMP存在不依赖于蛋白激酶A的方式介导下游信号激活,克隆了编码鸟嘌呤核苷酸交换因子的基因,将其命名为Epac｡同年,Kawasaki等鉴定出Epac存在2种亚型,分别为Epac1和Epac2,其中Epac2又分为Epac2A､Epac2B和Epac2C｡Epac1在子宫､卵巢､脂肪组织､肾脏､血管和中枢神经系统中高度表达,而Epac2A蛋白在大脑､胰腺和脑垂体中存在,Epac2B和Epac2C蛋白则分别在肾上腺和肝脏中含量较多｡相较于Epac2,Epac1在中枢神经系统中含量更多,与CIRI关系更为密切｡

Rap1是一种小G蛋白,属于Ras癌基因家族成员之一｡与其他G蛋白相同,Rap1与鸟苷三磷酸结合时具有活性,而与鸟苷二磷酸结合时无活性｡Rap1在细胞中可被多种刺激因子激活,但主要受Rap1鸟嘌呤核苷酸交换因子和鸟苷三磷酸酶激活蛋白的调控｡Rap1信号通路参与了多种生物学过程,如细胞黏附､细胞极性､细胞增殖和细胞分化等,同时在炎症反应中也发挥了重要作用｡

3 Epac1/Rap1信号通路与CIRI相关病理机制

CIRI是缺血性卒中较为常见的并发症,可导致患者出现肢体活动障碍､认知功能障碍等,对患者的生活造成严重伤害｡既往有研究表明,Epac1/Rap1信号通路与心肌损伤､肾脏损伤等密切相关｡但近期有研究显示,Epac1/Rap1信号通路可通过多种调控机制缓解CIRI,如血-脑屏障损伤､炎症反应､细胞凋亡等｡故调控该通路对CIRI患者的预后具有重要研究价值,或可为临床治疗提供新靶点｡

3.1 血-脑屏障损伤

正常的中枢神经系统具有高度特异性和动态稳定的脑内微环境｡血-脑屏障作为血液和神经组织之间重要屏障层,主要控制物质进出脑组织,保证正常的营养供给,在维持中枢神经系统微环境的稳定性中发挥着重要的作用｡血-脑屏障主要由血脑微血管内皮细胞､内皮细胞紧密连接(tight junction,TJ)､神经胶质细胞､星形胶质细胞､周细胞､基膜等组分构成｡其中,TJ作为血-脑屏障的结构基础,通过细胞旁路径调控各类物质跨膜转运,其主要由封闭蛋白､紧密连结蛋白5､连接黏附分子､紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)和细胞骨架蛋白构成｡其中较为常见的是ZO-1和紧密连结蛋白5,二者位于内皮细胞旁,主要功能是连接相邻的两个细胞,使细胞间的间隙封闭,阻挡细胞外的大分子物质通过细胞间隙进入组织内部｡

CIRI的显著病理特征是以TJ结构损伤和通透性增加为主的血-脑屏障功能障碍｡当机体发生CIRI时,血-脑屏障上TJ所含有的各类蛋白结构受损,微血管内皮细胞的细胞骨架改变,肌动蛋白聚合形成应力纤维,使内皮细胞收缩从而增大了细胞间隙,导致血-脑屏障的通透性增加甚至破裂,各种高分子化合物流出且外界有害物质流入中枢神经系统,进一步加重脑组织损伤｡而TJ所含有的跨膜蛋白通过副蛋白连接到肌动蛋白的细胞骨架,且TJ的有效表达可以调控血-脑屏障的通透性｡

TJ所包含的封闭蛋白､紧密连结蛋白5和ZO-1等蛋白具有不同的分子结构和调控特性,对维持TJ的功能和血-脑屏障的稳定性有着非常重要的作用｡Jiang等通过蛋白免疫印迹法发现,当血液再灌注时间增加时,大鼠模型的ZO-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)｡该实验结果还显示,大鼠脑缺血-再灌注后可诱导基质金属蛋白酶9(MMP-9)活化,MMP-9可降解细胞外基质和TJ,导致血-脑屏障损伤｡Sun等的动物实验结果显示,小鼠CIRI发生后3h,封闭蛋白和紧密连结蛋白5蛋白表达量开始下降;在其发生后的6h,ZO-1蛋白表达量下降,血-脑屏障的通透性增加,小分子开始向外渗漏｡此外,该实验通过观测大分子示踪剂异硫氰酸荧光素在小鼠脑实质中的渗出量对血-脑屏障通透性进行评估,结果显示,与未激活Epac1/Rap1信号通路的CIRI后24h小鼠比较,激活mEpac1/Rap1信号通路的CIRI后24h小鼠示踪剂向脑实质的渗出体积降低(18mm³比47mm³,P<0.05),提示激活Epac1/Rap1信号通路可使血-脑屏障通透性显著降低｡该实验结果显示,激活Epac1/Rap1信号通路的CIRI小鼠紧密连结蛋白5､ZO-1蛋白相对表达量较未激活Epac1/Rap1信号通路的CIRI小鼠均上升,组间差异均有统计学意义(均P<0.05),表明激活Epac1/Rap1信号通路可增加TJ蛋白表达量｡储伟的动物实验结果表明,给予CIRI模型小鼠尾静脉注射糖蛋白可增加Epac1蛋白表达｡该实验结果显示,小鼠CIRI造模后30min给予尾静脉注射糖蛋白(20μmg/kg)较未注射糖蛋白的CIRI模型小鼠的Epac1紧密连结蛋白5､ZO-1蛋白相对表达量均增加(均P<0.05);此外伊文思蓝微血管通透性实验结果显示,给予尾静脉注射糖蛋白的CIRI模型小鼠脑组织中伊文思蓝染料含量为3.8ng/mg,未注射糖蛋白的模型小鼠为6.2ng/mg,表明Epac1蛋白表达增加后,伊文思蓝染料渗透量下降,血-脑屏障通透性降低(P<0.05)｡上述实验结果表明,激活Epac1/Rap1信号通路可降低受损血-脑屏障的通透性,减轻CIRI,研究该通路对CIRI的防治具有重要意义｡

3.2 炎症反应

炎症反应是CIRI引发神经损伤的关键病理生理机制｡脑缺血早期,肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌及合成增加,导致脑组织损伤加重;当血液再灌注后,大量的TNF-α表达不仅会促进CIRI的炎症反应,进一步加重脑组织损伤,同时可激活星形胶质细胞和小胶质细胞释放继发性炎症介质,如白细胞介素1β(IL-β)｡IL-β具有较强的促炎作用,通过相关促炎介质激活,进而导致继发性炎症反应｡当CIRI发生时,IL-β可过度激活IL-6,引发胶质细胞和神经元损伤｡

激活Epac1/Rap1信号通路虽然能够减轻血-脑屏障损伤,但同时也会引发脑组织炎症反应｡高见等的实验在大鼠进行CIRI造模前给予牡荆素(10mg/kg)腹腔注射,造模后24h进行蛋白检测,结果表明,给予牡荆素治疗的CIRI大鼠Epac1(相对蛋白表达量:0.25 ± 0.10比1.14 ± 0.17,P<0.05)､Rap1(相对蛋白表达量:0.23±0.05比0.24±0.07,P<0.05)蛋白表达明显低于未注射牡荆素的CIRI大鼠｡同时,该实验中给予牡荆素治疗后的大鼠IL-6(相对蛋白表达量:1.11±0.08比2.97±0.34,P<0.05)､TNF-α(相对蛋白表达量:1.26 ± 0.13比1.52 ± 0.06,P< 0.05)相较于未经治疗大鼠水平均显著下降｡另外,大鼠脑切片经苏木素-伊红染色切片图像对比显示,给予牡荆素注射的CIRI大鼠与未注射的CIRI大鼠相比细胞核较为清晰,细胞凋亡率下降[(14.38 ± 2.14)%比(36.54 ± 4 .21)%,P<0.05],且脑组织梗死率显著下降[(8.57 ± 1.43)%比(40.85 ± 3.54)%,P<0.05]｡

张奇龙采用小鼠海马神经细胞构建低氧复氧模型,即将小鼠海马神经细胞接种在培养皿中,当细胞长至培养皿底部面积80%后加入无氧无糖培养基,将其放入恒温37℃,且含有1%氧气和5%二氧化碳的气体培养箱进行缺氧培养5h,然后将无氧无糖培养基更换为正常培养基,换至正常培养箱中复氧24h,模拟机体CIRI｡该实验结果显示,常氧条件下小鼠神经细胞状态良好,分布均匀且无细胞损伤情况;低氧复氧模型组中细胞形状大小不一,细胞间连接数量下降,培养皿中出现大量坏死细胞;而细胞分别经牡荆素5μmol/L和牡荆素10μmol/L预先孵育24h后进行低氧复氧给药造模后,镜下观察培养皿显示,牡荆素5μmol/L给药组和牡荆素10μmol/L给药组较低氧复氧模型组细胞坏死情况均减轻(均P<0.05)｡除此之外,蛋白免疫印迹测定结果显示,与低氧复氧模型组比较,牡荆素10μmol/L给药组Epac1､Rap1相对蛋白表达量均明显上升(均P<0.05),而IL-6含量相对下降(P<0.01)｡此外,细胞活力检测结果显示,与常氧条件下的细胞比较,低氧复氧模型组细胞存活率降低(P<0.01),表明细胞低氧复氧后活性明显降低;但牡荆素(10μmol/L)给药组细胞存活率高于低氧复氧模型组(P<0.01),提示通过调控Epac1/Rap1信号通路可减轻CIRI后炎症反应｡

3.3 细胞凋亡

细胞凋亡是机体的一种重要生物学现象,可通过去除多余或异常的细胞调节和维持内环境的稳定,并在多个系统的发育中发挥重要的作用｡当细胞凋亡发生时,首先细胞体积缩小,细胞连接消失并与周围的细胞脱离;然后细胞中线粒体电位紊乱导致其通透性改变,释放细胞色素C到胞浆中,引起核膜核仁破碎,DNA降解为180~200bp的片段;最后胞膜形成小泡,使膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻至膜表面,将细胞废物包裹为凋亡小体｡

细胞凋亡是CIRI的重要发病机制,与脑损伤密切相关｡细胞凋亡涉及多种途径,其中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)激活是细胞凋亡的中心环节｡既往有研究显示,当CIRI发生时,促凋亡调节蛋白Caspase-3表达明显增强｡王坤等给予大鼠人参皂苷Rg160μmol/L灌胃14d后构建CIRI模型,结果显示,与未灌胃的CIRI模型组大鼠比较,人参皂苷Rg160μmol/L灌胃组Epac1､Rap1､Caspase-3相关蛋白表达量均降低,组间差异均具有统计学意义(均P<0.05)｡该实验尼氏染色结果显示,CIRI大鼠脑组织完整神经细胞为11个,人参皂苷Rg160μmol/L灌胃组CIRI大鼠完整神经细胞为19个(P<0.05),表明通过抑制Epac1/Rap1信号通路可减轻细胞凋亡,对缓解CIRI有重要作用｡

4 总结

Epac1/Rap1信号通路作为一条新发现的信号通路,具有重要的研究意义｡既往关于该信号通路的研究多与心肌损伤相关｡吴华英等的动物实验结果显示,益气活血方可通过激活Epac1/Rap1信号通路,改善冠心病气虚血瘀证大鼠心功能,降低血液黏度｡另外,薛威的动物实验结果显示,给予心肌缺血大鼠牡荆素治疗,可上调Epac1/Rap1信号通路表达,抑制线粒体介导的凋亡途径的激活,减轻心肌损伤｡

CIRI的发生包含多种分子机制,目前研究中与Epac1/Rap1信号通路相关的机制包括血-脑屏障､炎症反应和细胞凋亡｡但对Epac1/Rap1信号通路与CIRI的研究多停留在动物实验和细胞实验,仍缺少针对Epac1/Rap1信号通路治疗CIRI的特异性药物｡CIRI发病机制复杂,Epac1/Rap1信号通路相关药物的研发可能有助于CIRI的后续治疗｡