【BJH】杜鹃教授团队发现二甲双胍可增强GPRC5D CAR-T疗效

GPRC5D CAR-T

GPRC5D是多发性骨髓瘤(MM)的关键CAR-T细胞靶点之一，已在I/II期研究中得到验证，抗GPRC5D CAR-T细胞在治疗复发和难治性MM具有良好疗效和可控安全性。然而，GPRC5D CAR-T治疗的一个挑战在于GPRC5D蛋白表达减少或缺失，从而影响疗效。

二甲双胍是一种常用的治疗2型糖尿病的药物，对多种肿瘤细胞具有显著的抗癌活性，特别是在MM中，二甲双胍可以特异性降低IL-6R的表达，抑制IL-6信号通路，后者在MM的发病机制中起着至关重要的作用。二甲双胍还与地塞米松、泊马度胺和硼替佐米具有协同抑制作用。

临床前研究已证实二甲双胍和免疫疗法之间的协同作用。二甲双胍通过下调癌细胞上PD-L1的表达，从而改善CD8 T细胞靶向肿瘤的功能，从而调节肿瘤微环境。二甲双胍还可增强CD8 T细胞在缺氧条件下的适应性，保护其免受缺氧诱导的凋亡，并降低抑制受体的表达。然而，二甲双胍预处理骨髓瘤细胞是否会改变GPRC5D CAR-T细胞的疗效尚不清楚。

因此海军军医大学第二附属医院（上海长征医院）杜鹃教授团队研究了二甲双胍与GPRC5D CAR-T细胞的潜在协同免疫作用，结果近日发表于《British Journal of Haematology》。

研究结果

首先，为确定用于GPRC5D CAR-T分析的最佳二甲双胍浓度，作者进行了CCK8实验来研究二甲双胍预处理的效果。该实验有助于选择1 mM的浓度进行其余的研究，因其对骨髓瘤细胞和非骨髓瘤细胞的活力几乎没有影响。虽然在进行基于荧光素酶的杀伤实验时，二甲双胍被从预处理的骨髓瘤细胞中去除，但作者进一步评估了1mm二甲双胍是否对CAR-T细胞有影响，并发现1mm二甲双胍不影响GPRC5D CAR-T细胞的活力。同时，磷酸缓冲盐水(PBS)组与二甲双胍组CAR-T细胞的凋亡比例和细胞周期均无差异。此外1 mM二甲双胍未改变CAR-T细胞表面GPRC5D CAR的表达。

随后作者研究了二甲双胍预处理对GPRC5D CAR-T细胞毒性的影响。用1 mM二甲双胍预处理骨髓瘤细胞96小时，无论是GPRC5D阳性的L363-luci细胞还是GPRC5D阴性的KMS11-luci细胞，E:T比为4:1的情况下都会导致对GPRC5D CAR-T细胞毒性的敏感性增加，表现为在4小时基于荧光素酶的杀伤实验中检测到裂解升高(图1A、B)。1mM二甲双胍预处理GPRC5D阳性L363-luci细胞96h，裂解率从48.71%增加到58.70%(图1A)，而GPRC5D阴性的KMS11-luci细胞裂解率从13.07%增加到26.21%(图1B)。在原代细胞中也观察到同样的效果，7-AAD+细胞比例升高，从而证实对GPRC5D CAR-T细胞细胞毒性的敏感性增加(图1C)。此外，二甲双胍预处理对GPRC5D CAR-T细胞细胞毒性的影响仅针对骨髓瘤细胞，因为二甲双胍预处理的GPRC5D CAR-T细胞对HEK293的细胞毒性没有增加。

然后通过分析分子读数来评估CAR-T活性，包括CD107a、干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α的产生。GPRC5D CAR-T细胞表面CD107a表达升高，从而证实对GPRC5D CAR-T细胞毒性的敏感性增加。GPRC5D阳性L363细胞中PBS组和二甲双胍组的CD107a在GPRC5D CAR-T细胞中的表达从39.40%增加到51.43%(图1D、F)，GPRC5D阴性KMS11细胞中PBS组和二甲双胍组的CD107a在GPRC5D CAR-T细胞中的表达从12.07%增加到30.57%(图1E、G)。靶细胞暴露后，IFN-γ和TNF-α的生成也增加(图1H-K)。GPRC5D阳性L363细胞的PBS组和二甲双胍组的IFN-γ产量从31.17%提高到44.00%(图1H)， PBS组和二甲双胍组GPRC5D阴性KMS11细胞的存活率为9.50% ~ 21.50%(图1I)，GPRC5D阳性L363细胞PBS组和二甲双胍组的TNF-α产量从33.70%提高到44.77%(图1J)， PBS组和二甲双胍组的GPRC5D阴性KMS11细胞从15.30%增加到26.17%(图1K)。这些结果表明，与对照组相比，二甲双胍预处理的GPRC5D CAR-T细胞对人骨髓瘤细胞系的细胞毒性显著增强。

肿瘤抗原丢失是抗原特异性T细胞治疗失败的主要机制。接下来作者利用流式细胞术检测二甲双胍治疗骨髓瘤细胞是否增加表面GPRC5D以提高CAR-T细胞识别。暴露于1mM二甲双胍96h后，L363和KMS11细胞表面GPRC5D分别增加1.60倍(图2A、C)和2.58倍(图2B、D)。此外，用二甲双胍预处理这些细胞系96h后，表面GPRC5D呈剂量依赖性增加。骨髓瘤细胞经1mM二甲双胍预处理后，GPRC5D RNA表达增加，与细胞表面蛋白表达一致(图2E、F)。更重要的是，二甲双胍预处理还可增强原代细胞中GPRC5D的表达(图2G)。

总结

该研究证实，二甲双胍预处理可增强MM上GPRC5D的表达，使骨髓瘤细胞对GPRC5D CAR-T细胞敏感，从而为测试二甲双胍联合GPRC5D CAR-T细胞以加深治疗反应提供了令人信服的理由。当然，二甲双胍增强GPRC5D CAR-T细胞疗效的机制还需要进一步研究。

参考文献

Hu X,Zhou X,Zhao Q,et al.Metformin augments GPRC5D in multiple myeloma and enhances the efficacy of GPRC5D-CAR T cells.Br J Haematol . 2024 Sep 3. doi: 10.1111/bjh.19739.