【论著】| m6Am修饰酶PCIF1调控靶基因ACOT8参与胃癌进展的机制研究

［摘要］  

背景与目的：最新证据显示N6, 2'-O- 二甲基腺苷（N6, 2'-O-dimethyladenosine，m6Am）修饰酶磷酸化C末端结构域相互作用因子1（phosphorylated c-terminal domain-interacting factor 1，PCIF1）可能是胃癌的重要生物标志物及治疗靶点。然而，这种新的PCIF1分子机制与胃癌进展的关系仍有待进一步探索。本研究分析PCIF1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用及其调控靶基因酰基辅酶A硫代酯酶8（acyl-CoA thioesterase 8，ACOT8）在胃癌进展中的机制。

方法：使用基因表达谱交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）分析胃癌患者的胃癌组织和非胃癌组织中的PCIF1表达，并分析了PCIF1表达与胃癌患者总生存率的相关性。收集2019年——2021年长沙市第一医院消化内科就诊患者的89对胃癌组织和匹配的癌旁组织。通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）分析PCIF1表达。在体外实验中，将SNU5细胞分为PCIF1敲低（sh-PCIF1）组和相应对照（sh-NC）组，将AGS细胞分为载体对照组（normal control，NC）组和PCIF1过表达（PCIF1）组。使用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）和transwell法分析了PCIF1对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。此外，在PCIF1过表达的AGS细胞中敲低ACOT8并进行了拯救实验。采用皮下异种移植瘤模型来测定PCIF1在胃癌中的生物学效应。

结果：PCIF1在胃癌组织和细胞系中呈高表达，并且PCIF1高表达胃癌患者的预后较差。与sh-NC组相比，sh-PCIF1组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著降低（P＜0.05）。与NC组相比，PCIF1组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著增加（P＜0.05）。在PCIF1过表达的AGS细胞中，敲低ACOT8的表达可降低细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数。在体内实验中，与NC组相比， PCIF1过表达组裸鼠的移植瘤体积和重量均显著增加（P＜0.05）。

结论：PCIF1在胃癌细胞系和组织中上调。此外，PCIF1/ACOT8轴参与介导胃癌细胞的恶性行为产生。

［关键词］ N6, 2'-O-二甲基腺苷；磷酸化C末端结构域相互作用因子1；酰基辅酶A硫代酯酶8；胃癌；增殖；转移

胃癌在世界范围内普遍存在，其特点是早期诊断存在困难；大多数患者在确诊后往往错过最佳治疗时机，即使治疗后5年生存率也不足20%，严重威胁人类健康^［1］。胃癌发病机制涉及多种因素、发育过程中的多个步骤以及多重基因突变和异常^［2］。因此，迫切需要确定胃癌早期的诊断标志物和治疗靶点。最近，表观转录组学已成为癌症研究的一个有吸引力的领域^［3］。在RNA中发现了100多种转录后修饰方式，其中N6, 2'-O-二甲基腺苷（N6, 2'-O-dimethyladenosine，m6Am）是一种可逆的RNA修饰，有利于mRNA的翻译、表达和稳定性^［4］。先前的研究^［5］已将磷酸化C末端结构域相互作用因子1（phosphorylated C-terminal domain-interacting factor 1，PCIF1）确定为m6Am写入蛋白，其通过调节胰岛β细胞的功能或存活参与葡萄糖稳态。抑制PCIF1介导的mRNA中m6Am修饰会导致结直肠癌干细胞能力降低^［6］。值得注意的是，还有学者发现PCIF1激活在胃癌的发生和发展中起着重要作用，并且可能是胃癌的重要生物标志物及治疗靶点^［7］。然而，PCIF1作用的分子机制及其与胃癌进展的关系仍有待进一步探索。在本研究中，我们分析了PCIF1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用及分子机制。

1 材料和方法

1.1  GEPIA数据库分析

从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中获得408个胃癌组织和211个非胃癌组织的mRNA表达谱并进行分析。利用基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）计算胃癌患者的10年总生存（overall survival，OS）率，并分析其与PCIF1的相关性。

1.2  临床标本

收集2019年—2021年从长沙市第一医院获得89对胃癌组织和非胃癌组织（距胃癌边缘超过5 cm）。没有患者术前接受局部或全身化疗、放疗或靶向治疗，所有组织均由两名病理学家进行组织学鉴定。切除的标本立即处理并储存在-80℃。所有患者都签署了知情同意书。

1.3  细胞培养

正常人胃黏膜细胞系（GES-1）和胃腺癌细胞系（AGS、MKN45、SNU-5和NCI-N87；美国ATCC）接种在含有10%胎牛血清（美国Gibco公司）和1%双抗生素（青霉素/链霉素，美国Thermo Fisher Scientific公司）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。

实验1考察PCIF1对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。将SNU5细胞分为PCIF1敲低（sh-PCIF1）组和相应对照（sh-NC）组；其中sh-NC组和sh-PCIF1组分别使用Lipofectamine^TM3000将sh-NC或sh-PCIF1转染细胞24 h。将AGS细胞分为载体（NC）组和PCIF1过表达（PCIF1）组；其中NC组和PCIF1组AGS细胞分别使用Lipofectamine^TM3000将NC或PCIF1质粒转染细胞24  h。实验2考察PCIF1和酰基辅酶A硫代酯酶8（Acyl-CoA thioesterase 8，ACOT8）在胃癌细胞中的作用相互关系。将AGS细胞分为NC组、PCIF1组、PCIF1 + sh-NC组和PCIF1 + sh-ACOT8 组。

1.4  细胞转染

将AGS细胞以5×10⁴个细胞/mL接种到6孔板中，并在细胞密度达到约70%时，根据Lipofectamine^TM3000（美国Thermo Fisher Scientific公司）的说明将PCIF1质粒、PCIF1 shRNA（sh-PCIF1）、ACOT8 shRNA（sh-ACOT8）和相应的NC（上海GenePharma公司）转染细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）检查转染效率。

1.5  RTFQ-PCR分析

采用TRIzol试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）从胃癌组织或细胞获得总RNA。然后，使用PrimeScript RT Reagent Kit（日本TaKaRa公司）进行反转录，使用TB Green Premix Ex TaqⅡ（日本TaKaRa公司）在ABI-7900 RTFQ-PCR系统（美国Applied Biosystems公司）进行RTFQ-PCR检测。RTFQ-PCR检测用的引物由广州吉赛生物科技股份有限公司设计合成。使用标准的2^-ΔΔCT（周期阈值）方法测定PCIF1、ACOT8的相对表达水平。用于RTFQ-PCR的引物序列如下：ACOT8有义链5'-AGCTCCCGTGCCTTATGGTTA-3'，反义链5'-GGCTGGTAGGTTCCCGGAT A-3'；PCIF1有义链5'-ACTTGGCTCCCTTATCTGACC-3'，反义链5'-TGTGCAGTGTGAGAAAGGCTT-3'；GAPDH有义链5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反义链5'-GGCTGTTGTCATA CTTCTCATGG-3'。

1.6  RNA免疫沉淀定量聚合酶链反应（RNA immunoprecipitation quantitative polymerase chain reaction，RIP-qPCR）分析

使用离心柱（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit；日本TaKaRa公司）以获得完整的总RNA，然后使用polyATtract mRNA分离系统（美国Promega公司）处理mRNA以进行纯化。随后，使用PCIF1或IgG抗体进一步用于RIP-qPCR以检测PCIF1结合ACOT8 mRNA。通过RIP-qPCR对产生的IP进行分析。 

1.7  蛋白质印迹法（Western blot）检测

通过放射免疫沉淀测定缓冲液制备胃癌组织或细胞蛋白质，并通过二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质测定试剂盒（上海Beyotime公司）进行定量。对样品进行10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜（美国Millipore公司）。将膜用5%脱脂牛奶封闭，用一抗在4℃下温育过夜，并与相应的HRP偶联二抗温育，通过化学发光法检测印迹带。使用的抗体包括针对PCIF1和GAPDH（作为阴性对照）的抗体购自英国Abcam公司，一抗均购自美国Proteintech公司。

1.8  细胞增殖试验

细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自日本Dojindo公司，将其和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）掺入试验评估细胞活力：将1×10³个细胞接种到96孔板中并温育过夜，在指定时间点（24、48、72、96和120 h）向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液试剂，并将细胞在黑暗中温育2 h。随后，通过Bio-Tek Elx 800酶标仪（美国Bio-Tek Instruments公司）测量450 nm波长处的吸光度（D）值。对于EdU测定，使用Cell-Light EdU Apollo 488体外成像试剂盒（广州锐博生物技术有限公司）检测胃癌细胞的DNA合成。在24孔板中培养总共5×10⁴个细胞。随后，将细胞与EdU溶液一起温育2 h，与1×Apollo反应混合物反应30 min，并用Hoechst 33342染色30 min。通过ZEISS LSM800共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss AG公司）对细胞进行检测和成像。

1.9  Transwell检测

将转染的胃癌细胞（2×10⁴个细胞/孔）接种在transwell小室（美国Corning公司）中用于迁移测定，或接种在预涂有100 μL 1 μg/μL的Matrigel基质胶（美国BD Biosciences公司）的小室中用于侵袭性测定。分别将无血清培养基和完全培养基添加到上室和下室。温育24 h后，侵入的细胞用4%的多聚甲醛固定，1%的结晶紫染色，显微镜下拍照。

1.10  动物实验

BALB/c裸鼠（雌性，6~8周）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠随机分为NC组和PCIF1组，每组6只。将稳定转染的PCIF1过表达的AGS细胞（1×10⁶个细胞）或载体转染细胞皮下注射到裸鼠的右背侧。在指定的时间点监测肿瘤体积。注射后25 d，处死小鼠，切除肿瘤，称重，拍照。

1.11  免疫组织化学检测

将移植瘤组织固定在4%的多聚甲醛中，并将石蜡包埋的组织切成4 μm的切片。阻断内源性过氧化物酶活性后，切片与一抗在4℃下温育过夜，然后在37℃下与HRP偶联的二抗温育1 h。接下来，切片用HRP底物进行DAB染色。免疫组织化学检测用PCIF1和ACOT8抗体购自英国Abcam公司。 

1.12  统计学处理

所有数据均以x±s的形式呈现。使用Student’s t检验（双尾）或单因素方差分析（ANOVA）检验分析实验结果。P＜0.05为差异有统计学意义。数据统计分析均使用SPSS 21.0进行处理。

2 结  果

2.1  PCIF1在胃癌组织和细胞中表现出显著升高的表达

首先，我们分析了GEPIA数据库和临床样本，发现PCIF1在胃癌组织中的表达显著增加（图 1A~C）。然后，使用GEPIA数据库分析了PCIF1表达水平与胃癌患者OS之间的相关性，发现PCIF1低表达患者具有更好的生存预测（图1D）。此外，胃癌细胞系（AGS、BGC823、MKN45 和 SGC7901）中PCIF1的表达显著高于非胃癌细胞系（GES-1）中的表达（图1E）。上述结果表明，PCIF1在胃癌组织和细胞中的表达明显更高。 

图1  胃癌组织和细胞中PCIF1表达 

Fig. 1 Expression of PCIF1 in gastric cancer tissues and cells

A: The expressions of PCIF1 in gastric cancer tissues and normal control tissues were evaluated by GEPIA database; B: The relative expression levels of PCIF1 in para-cancerous tissues (P) and gastric cancer tissues (T) were examined by Western blot; C: The relative expression levels of PCIF1 in gastric cancer tissues and non-gastric cancer tissues were examined by RTFQ-PCR; D: GEPIA database analysis revealed that the high expression of PCIF1 indicated that the overall survival prediction of gastric cancer patients was better; E: The expression level of PCIF1 in gastric cancer cell lines was examined by Western blot. **: P＜0.01, compared with para-cancerous tissues.

2.2  PCIF1是胃癌细胞恶性行为所必需的

为了评估PCIF1在胃癌中的作用，我们通过shRNA在SNU5细胞中稳定地敲低了PCIF1的表达（图2A）。与sh-NC组相比，sh-PCIF1组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著降低（P＜0.05，图2B~F）。此外，我们通过慢病毒在AGS细胞中过表达PCIF1（图3A）。与NC组相比，PCIF1过表达组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著增加（P＜0.05）（图3B~F）。这些数据表明，PCIF1在体外促进胃癌增殖和迁移。 

图2  敲除PCIF1在体外抑制胃癌增殖、迁移和侵袭

Fig. 2 Knockout PCIF1 inhibits the proliferation, migration and invasion of gastric cancer in vitro

A: RTFQ-PCR was used to evaluate the expression of PCIF1 knocked down by shRNA in SNU5 cells; B: CCK-8 assay was performed to evaluate the viability of SNU5 cells silenced by PCIF1; C: EdU assay was performed to evaluate the proliferation ability of SNU5 cells silenced by PCIF1; D-F: The effect of PCIF1 knock-down on migration and invasion of SNU5 cells was detected by transwell assay. *:P＜0.05, compared with sh-NC group; **:P＜0.01, compared with sh-NC group; ***: P＜0.001, compared with sh-NC group.

图3  PCIF1在体外促进胃癌增殖、迁移和侵袭

Fig.3 PCIF1 promotes the proliferation, migration and invasion of gastric cancer in vitro

A: RTFQ-PCR was used to evaluate the expression of PCIF1 upregulated by lentivirus in AGS cells; B: CCK-8 assay was performed to evaluate the activity of AGS cells up-regulated by PCIF1; C: EdU assay was performed to evaluate the proliferation ability of AGS cells up-regulated by PCIF1; D-F: Transwell was used to detect the effect of PCIF1 upregulation on the migration and invasion of AGS cells. *: P＜0.05, compared with NC group; **:P＜0.01, compared with NC group; ***:P＜0.001, compared with NC group.

2.3  PCIF1调节胃癌中的ACOT8表达

为了进一步研究PCIF1在胃癌增殖和侵袭中的作用机制，首先对m6A2Target数据库中潜在的修饰底物进行了预测，显示ACOT8是A549细胞系中经过验证的PCIF1修饰底物。然而，在胃癌中 PCIF1和ACOT8之间的关系仍不清楚。因此，我们通过GEPIA数据库分析了胃癌中PCIF1和ACOT8之间mRNA表达的相关性，结果显示， PCIF1表达水平与ACOT8表达水平显著相关（图4A）。过表达PCIF1增强了AGS细胞中ACOT8 mRNA的表达（图4B）。RIP-qPCR结果显示，过表达PCIF1显著增强了AGS细胞中PCIF1结合ACOT8 mRNA的富集（图4C）。此外，测量了用RNA合成抑制剂α-鹅膏菌素处理的AGS细胞中ACOT8 mRNA的损失，结果显示PCIF1过表达延长了AGS细胞中ACOT8 mRNA的半衰期（图4D）。

图4  PCIF1调节胃癌中的ACOT8表达 

Fig. 4 PCIF1 regulates the expression of ACOT8 in gastric cancer

A: The correlation between PCIF1 and ACOT8 expression was analyzed by GEPIA database. B: RTFQ-PCR was used to evaluate the effect of overexpressing PCIF1 on ACOT8 expression in AGS cells (***:P＜0.001, compared with NC group). C: RIP-qPCR was used to detect the enrichment of PCIF1 combined with ACOT8 in AGS cells (*: P＜0.05, compared with IgG in NC group; #:P＜0.05, compared with sh-PCIF1 in NC group). D: Overexpression of PCIF1 prolonged the half-life of ACOT8 mRNA in AGS cells (*:P＜0.05, compared with NC group).

2.4  PCIF1通过调节ACOT8抑制胃癌细胞增殖和侵袭

为了证实PCIF1通过ACOT8发挥促肿瘤作用，我们敲低了PCIF1过表达的AGS细胞中ACOT8的表达并进行了拯救实验（图5A）。与PCIF1组相比，PCIF1 + sh-ACOT8组的细胞活力、EdU阳性细胞、迁移和侵袭细胞数均显著降低（P＜0.05，图5B~F）。这些数据表明PCIF1通过调节ACOT8促进胃癌细胞增殖和侵袭。 

图5  PCIF1通过ACOT8发挥其促肿瘤作用 

Fig. 5 PCIF1 exerts its tumor-promoting effect through ACOT8

A: RTFQ-PCR was used to confirm the efficiency of sh-ACOT8 in PCIF1 overexpressing AGS cells; B: CCK-8 assay was performed to assess the effect of ACOT8 silencing on the proliferative capacity of PCIF1 overexpressing AGS cells; C: EdU analysis of the effect of ACOT8 silencing on the proliferation of PCIF1 overexpressing AGS cells; D-F: Transwell assessment of the effect of ACOT8 silencing on migration and invasion of PCIF1 overexpressing AGS cells. *: P＜0.05, compared with NC group;**: P＜0.01, compared with NC group;***: P＜0.001, compared with NC group; #: P＜0.05, compared with PCIF1 group; ##:P＜0.01, compared with PCIF1 group; ###: P＜0.001, compared with PCIF1 group.

2.5  PCIF1在体内促进胃癌生长

采用皮下异种移植瘤模型来测定PCIF1对胃癌生长表达的影响。与NC组相比，PCIF1过表达组裸鼠的肿瘤体积和重量均显著增加（P＜0.05，图6A~C）。免疫组织化学检测结果显示，PCIF1过表达组肿瘤组织中PCIF1和ACOT8的表达水平均明显增加（图6D）。

图6  PCIF1在体内促进胃癌生长 

Fig. 6 PCIF1 promotes the growth of gastric cancer in vivo

A: Representative tumors after transplantation of PCIF1 overexpression or negative control AGS cells into nude mice; B: Comparison of tumor volumes in PCIF1 overexpressing or negative AGS cell transplanted tumor nude mice; C: Comparison of tumor weights; D: Expression levels of PCIF1 and ACOT8 in tumor tissues were determined using immunohistochemistry. *:P＜0.05, compared with NC group; **:P＜0.01, compared with NC group.

3 讨　　论

研究^［7-8］表明，m6Am修饰的异常与包括胃癌在内的多种肿瘤的发生、发展过程密切相关。Hu等^［8］研究发现，血清中的m6Am可能作为结直肠癌和胃癌的早期发现和预后预测的潜在生物标志物。有研究^［6］发现，FTO介导的细胞质m6Am去甲基化调节结直肠癌细胞的干细胞样特性。然而，PCIF1作为最新发现的m6Am唯一已知的修饰酶^［9］，其是否参与胃癌的进展仍不清楚。因此，我们目前的研究集中在PCIF1的作用上，并发现胃癌中PCIF1表达升高，并且PCIF1表达升高与胃癌患者较差的生存率相关。我们证实PCIF1在体外可促进胃癌细胞的生长和侵袭能力，PCIF1通过介导ACOT8参与调节胃癌的进展。ACOT8随后被证实是胃癌的致癌驱动因子。总之，PCIF1/ACOT8轴在胃癌进展中发挥重要 作用。

m6Am是细胞mRNA和一些小核RNA中第二常见的修饰，它发生在mRNA帽附近^［10］。在正常生理条件下，甲基化修饰受到甲基转移酶和去

甲基化酶的精确调控，参与调控甲基化RNA的可变剪接、核输出、稳定性、翻译或降解，从而影响细胞代谢、细胞增殖和细胞分化^［11］。研究^［12］表明，由导致甲基化位点获得或丢失的突变或失调导致的RNA甲基化异常与包括胃癌在内的各种肿瘤的起始、进展转移和抑制密切相关。PCIF1作为唯一已知的哺乳动物mRNA m6Am甲基转移酶，到目前为止，只有两项研究证明了PCIF1在癌症中的作用。Zhuo等^［7］发现了circ-ATAD1/miR-140-3p/YY1/PCIF1信号转导通路在加速胃癌细胞进展中的作用。Relier等^［6］研究表明，PCIF1沉默减少了结肠球形成和m6Am/m6A比率，并导致CRC1结直肠癌细胞系对化疗产生耐药性。有研究^［13］通过泛癌分析探索PCIF1的致癌和免疫原性作用，结果显示，PCIF1表达与癌症患者预后及免疫浸润相关，表明它是癌症治疗的潜在靶点。本研究通过功能丧失和功能获得实验证明了PCIF1在体外促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并采用皮下异种移植瘤模型在体内验证了PCIF1的促肿瘤作用。 

此外，我们还研究了PCIF1抑制胃癌生长和转移的潜在机制。基于m6A2Target数据库中PCIF1的预测底物，ACOT8是PCIF1用于m6A修饰的潜在底物。因此，本研究验证了胃癌细胞中PCIF1和ACOT8之间的关系。值得注意的是，PCIF1不仅与来自TCGA数据库的STAD中的ACOT8表达呈正相关，而且RTFQ-PCR检测结果也证实了PCIF1在胃癌细胞中过表达后ACOT8的变化。此外，本研究结果还表明，PCIF1可以延长ACOT8 mRNA在胃癌细胞中的半衰期。ACOT8是一种过氧化物酶体脂解相关酶，催化脂肪酰基辅酶A分解为FFA和辅酶A分子进行β-氧化^［14］。由于ACOT8在直肠癌和肝癌细胞中高表达，已经有研究^［15-16］报道了ACOT8在肿瘤发生、发展中的潜在作用。随后，本研究通过拯救实验证实了PCIF1通过调节ACOT8促进胃癌细胞增殖和侵袭。以往研究^{［10，17- 18］}结果显示， m6Am修饰并不会改变 mRNA 转录或稳定性，因此PCIF1如何调节ACOT8表达有待于进一步 研究。

总之，本研究分析了PCIF1在胃癌中的作用机制。本研究结果表明，PCIF1在胃癌细胞系和组织中表达上调。此外，PCIF1/ACOT8轴参与介导胃癌细胞的恶性生物学行为产生。因此PCIF1可能是治疗胃癌的一个潜在靶点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

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