Nature Genetics：单细胞视角下的肿瘤增殖密码：SPRINTER精准解析克隆异质性的新工具

引言

癌症的发生和发展是一个复杂的生物学过程，其中一个核心特征便是肿瘤细胞的无限增殖能力。研究表明，肿瘤内的不同细胞群体，克隆（clones），可能具有独特的基因组特征和功能差异。然而，传统的实验和病理学技术大多基于整体样本的平均水平，难以揭示肿瘤内克隆之间的动态演化与差异化增殖。这不仅限制了对肿瘤复杂性本质的理解，也阻碍了针对特定癌症亚型开发精准治疗方案的进展。

为解决这一难题，11月29日 Nature Genetics的研究报道“Characterizing the evolutionary dynamics of cancer proliferation in single-cell clones with SPRINTER”，开发了一种名为 SPRINTER（Single-cell Proliferation Rate Inference in Non-homogeneous Tumors through Evolutionary Routes） 的算法，能够结合单细胞全基因组测序（single-cell whole-genome DNA sequencing, scDNA-seq）数据，准确识别并追踪肿瘤克隆中S期和G2期细胞的增殖模式。通过对14,994个非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的纵向数据分析，以及对乳腺癌和卵巢癌数据的验证，该方法不仅揭示了克隆间增殖率的显著异质性，还关联了高增殖克隆与癌症转移潜力、循环肿瘤DNA（ctDNA）释放等临床重要特征。

该研究在多个层面上拓展了对肿瘤进化和增殖动态的认识。SPRINTER通过创新的统计学和基因组分析方法，不仅克服了现有技术难以解析S期细胞的问题，还首次实现了肿瘤克隆增殖模式与其进化路径的联合分析。这为解析肿瘤内部异质性提供了新的工具，也为开发基于克隆特异性增殖特征的精准医学策略铺平了道路。

SPRINTER：揭示肿瘤克隆增殖异质性的技术创新

为了探究肿瘤内部克隆增殖的异质性，该研究采用了一种全新开发的算法——SPRINTER（Single-cell Proliferation Rate Inference in Non-homogeneous Tumors through Evolutionary Routes）。该算法基于单细胞全基因组DNA测序（scDNA-seq）数据，提供了从基因组层面高精度分析肿瘤克隆增殖动态的全新视角。这种方法不仅填补了以往技术难以解析S期细胞和克隆特异性增殖率的空白，还为研究肿瘤的进化路径和转移机制奠定了坚实基础。

SPRINTER的核心在于结合了复制时序（replication timing）与拷贝数变异（copy-number alterations, CNAs）的信息，通过六个步骤实现克隆增殖模式的高分辨率重建：首先，它利用实验验证的复制时序数据，对基因组进行早期和晚期复制区域的分区，并计算基于测序读数的深度比例。接着，通过统计方法推导出S期细胞的显著特征，包括早期复制区域读数升高与晚期区域读数降低的模式，从而准确识别S期细胞。随后，SPRINTER对非S期细胞的CNAs进行分析，以确定克隆的总体结构，并通过概率模型将S期细胞分配到对应的克隆中。此外，算法还进一步识别了G2期细胞，以补充克隆的增殖状态信息。

SPRINTER算法的关键步骤与结果解读（Credit: Nature Genetics）

步骤1：计算RDR和复制时序

SPRINTER的首要任务是对基因组每个bin（固定长度的基因组片段）计算读数深度比率（Read Depth Ratio, RDR）和复制时序（Replication Timing, RT）。复制时序通过区分早期复制区域（magenta）和晚期复制区域（green）标记细胞的复制特性，为后续S期细胞的识别奠定基础。

步骤2：识别拷贝数变异（CNA）的候选断点

SPRINTER在早期和晚期复制区域内独立识别CNA的候选断点（breakpoints）。仅保留那些在早期和晚期区域均支持的断点（红色虚线），剔除单侧支持的断点（灰色虚线），确保CNA片段的准确性。这一步骤的结果是初步定义了由CNA影响的基因组区段。

步骤3：通过统计测试识别S期细胞

通过对每个区段的RDR进行统计置换检验，SPRINTER能够鉴别S期细胞。在S期细胞中，早期复制区域显示较高的RDR值，而晚期区域显示较低的RDR值。非S期细胞（G0/G1/G2期）的RDR在复制时序上无显著差异。此步骤的结果是区分了S期细胞（底部行）和非S期细胞（顶部行），为后续克隆分配奠定基础。

步骤4：基于CNA推导克隆

对所有非S期细胞（G0/G1/G2期），SPRINTER通过其特定的CNA模式（黑色线条）进行分组，并推导出克隆结构。不同克隆以CNA的特征模式表示，细胞被归为具有相同CNA模式的克隆（彩色条）。这一步骤的结果是为非S期细胞建立克隆分类。

步骤5：将S期细胞分配到推导的克隆

SPRINTER将每个S期细胞分配到最可能的克隆（Maximum-a-Posteriori，MAP）。RDR数据经过复制波动的校正后，通过最大后验概率法选择最佳克隆分配（绿色对号）。结果是所有S期细胞被成功归类到推导的克隆中，并校正了克隆内的CNA模式。

步骤6：识别每个克隆的G2期细胞

SPRINTER通过去卷积分析总读数分布，将G2期细胞与G0/G1期细胞区分开。G2期细胞具有更高的总读数分布（黑色柱），而G0/G1期细胞的读数较低（浅灰色柱）。每个克隆的G2期细胞分数被成功量化。

SPRINTER的结果

最终，SPRINTER为每个细胞（行）提供了推导的CNA（颜色块）和细胞周期阶段（S期和G2期比例）。每个克隆的细胞周期状态被精确估计，包括S期细胞（深灰色条）和G2期细胞（黑色条）的比例。这一结果为分析肿瘤克隆的增殖模式、异质性及其演化提供了丰富的信息和高分辨率数据支持。

为了验证SPRINTER的可靠性，研究团队设计了一组严谨的实验，包括使用EdU标记和荧光激活细胞分选（FACS）技术生成的8,844个HCT116结直肠癌细胞的地面真值数据。这些数据涵盖了二倍体和四倍体细胞，为SPRINTER的算法性能提供了坚实的实验依据。与现有方法相比，SPRINTER在S期细胞识别和克隆分配精度上表现出显著提升，其在中晚期S期细胞分类中的准确率比传统方法提高了10%到90%。

在应用方面，SPRINTER被用于分析14,994个非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的纵向样本，揭示了肿瘤原发灶和转移灶中克隆间显著的增殖差异。通过与乳腺癌和卵巢癌数据的扩展应用，该方法进一步证实了其在多种癌症类型中的普适性。尤其值得关注的是，SPRINTER还通过复制时序变异（altered replication timing, ART）的分析，揭示了与转移潜力和基因表达调控相关的重要非遗传学特征。

这种创新性方法不仅为揭示肿瘤增殖异质性提供了强有力的工具，也为开发克隆特异性治疗策略打开了新思路，标志着癌症研究从群体平均到个体单细胞解析的转型。

肿瘤内部的“竞赛”：克隆增殖异质性的深度解析

肿瘤内部的细胞克隆并非以相同速度增殖，而是存在显著的异质性。通过SPRINTER算法对14,994个非小细胞肺癌（NSCLC）细胞进行分析，研究团队揭示了克隆间增殖差异的全貌。SPRINTER能够利用scDNA-seq数据，识别并量化每个克隆中S期和G2期细胞的比例，这些数据是评估克隆增殖活跃度的核心指标。

研究发现，在NSCLC样本中，克隆的增殖活跃度差异极为显著。一些克隆的S期细胞比例是其他克隆的两倍以上，而这些高增殖克隆通常主导了肿瘤的整体动态。例如，在原发肿瘤和转移灶中，SPRINTER识别出的高增殖克隆不仅增殖迅速，而且在细胞数量上占据主导地位。这种现象提示，肿瘤的增殖异质性可能是驱动癌症进展的重要机制之一。

此外，SPRINTER还发现，高增殖克隆的增殖特性并非随机分布，而是在某些转移灶中表现得尤为显著。例如，在右肾上腺和右枕叶转移灶中，SPRINTER识别的高增殖克隆的S期细胞比例比其他克隆高出50%以上。这些克隆的增殖能力不仅揭示了它们在癌症扩散中的核心作用，也为未来的靶向治疗策略提供了明确的方向。

高增殖克隆的双重角色：转移驱动者与ctDNA释放的主力

高增殖克隆不仅在肿瘤内部占据主导地位，还对转移和循环肿瘤DNA（ctDNA）释放产生深远影响。研究表明，这些克隆通常是肿瘤转移的核心驱动力。通过SPRINTER重建的肿瘤克隆进化图谱，研究团队发现，转移灶中的主导克隆往往来源于原发肿瘤中的高增殖克隆。例如，在NSCLC患者样本中，肝脏和脑转移的播散克隆（seeding clones）具有最高的S期细胞比例，并通过进化轨迹扩散至其他转移部位。

除了转移潜力，高增殖克隆还在ctDNA释放中扮演重要角色。SPRINTER的分析表明，克隆的S期细胞比例与其ctDNA释放能力显著正相关。研究进一步量化了每个克隆的ctDNA释放指数，发现高增殖克隆的释放水平是其他克隆的3倍以上。这一发现为液体活检技术提供了新方向。通过追踪特定ctDNA信号，临床医生可以实时监测肿瘤动态，并识别最具侵袭性的克隆，从而优化治疗策略。

非遗传机制的深入探索：复制时序变异驱动克隆特性

SPRINTER的另一个突破在于揭示了非遗传学因素对克隆特性的调控作用，特别是复制时序变异（altered replication timing, ART）。复制时序是一种与DNA复制有关的时间调控机制，通常在不同细胞类型中高度保守。然而，研究发现，高增殖克隆中常伴随显著的复制时序变异，这些变异可能通过调控基因表达直接影响克隆的增殖能力。

具体来说，在高增殖克隆中，KRAS基因的复制时序从晚期提前到早期，这种变异导致了KRAS基因表达水平的显著升高。而PDL1基因的复制时序变异则与其表达水平的下降相关，这可能促进了肿瘤的免疫逃逸能力。研究表明，这些复制时序变异不仅是高增殖克隆的重要特征，还可能通过影响基因表达驱动克隆的增殖和进化。

此外，SPRINTER还揭示了ART事件在克隆间的差异分布。例如，某些克隆的PIK3CA和CDK12基因显示出显著的ART，而这些基因的功能与细胞增殖密切相关。这一发现为理解癌症的非遗传学机制提供了新视角，也为开发靶向表观遗传改变的治疗策略提供了可能性。

跨癌种验证：SPRINTER的普适性与精准解析能力

为了验证SPRINTER的适用性，研究团队将其应用于乳腺癌和卵巢癌的数据集，进一步揭示了不同癌种中克隆增殖异质性的普遍性。在这两个癌种中，SPRINTER共分析了61,914个细胞，并识别出280个克隆。这些数据表明，高增殖克隆普遍表现出更多的遗传变异，包括单核苷酸变异（SNVs）、结构变异（SVs）和拷贝数变异（CNAs）。

例如，在乳腺癌数据集中，高增殖克隆中EGFR和CDK4等癌基因的扩增显著富集，而肿瘤抑制基因SMAD4和KEAP1的缺失则与增殖能力的增强相关。这些基因组特征与SPRINTER识别的增殖分数高度一致，进一步支持了高增殖克隆在癌症进展中的关键作用。

SPRINTER算法的开发和应用，为揭示癌症克隆增殖和进化动态提供了突破性工具。SPRINTER的核心贡献在于从单细胞分辨率揭示肿瘤克隆间的增殖异质性，突破了传统技术的局限。研究表明，肿瘤中的高增殖克隆通常主导转移和疾病扩散，这一发现重新定义了克隆在癌症进展中的作用。通过量化S期和G2期细胞比例，SPRINTER准确捕捉了克隆的动态变化，为理解肿瘤复杂性提供了新的研究框架。

高增殖克隆的识别为靶向治疗和疾病监测提供了新思路。SPRINTER揭示了高增殖克隆与循环肿瘤DNA（ctDNA）释放的关联，这为液体活检技术的优化奠定了基础。通过实时追踪ctDNA信号，临床医生可以评估患者的疾病动态并调整治疗策略，从而提升治疗的精准性。

SPRINTER不仅适用于非小细胞肺癌（NSCLC），还在乳腺癌和卵巢癌中验证了其普适性。未来，SPRINTER可结合其他单细胞技术（如转录组学和表观遗传学）进行多维度分析，探索遗传与非遗传因素如何协同驱动肿瘤演化。此外，针对复制时序变异（ART）的深入研究，有望发现新的癌症治疗靶点，为基础和临床研究提供指导。

参考文献

Lucas, O., Ward, S., Zaidi, R. et al. Characterizing the evolutionary dynamics of cancer proliferation in single-cell clones with SPRINTER. Nat Genet (2024). https://doi.org/10.1038/s41588-024-01989-z