Neuron：整合fMRI与光遗传学的全脑研究

近日，Myunghwan Choi和Seong-Gi Kim团队通过整合光遗传操作与fMRI技术，实现小鼠皮层神经激发的灵活操控，以研究动物大脑功能状态的动态变化。此技术具备空间、时间多功能性，与解剖学定义的轴突跟踪数据相一致，但受麻醉剂类型影响。他们的成果发表在最新一期的Neuron杂志上，名为“Whole-brain mapping of effective connectivity by fMRI with cortex-wide patterned optogenetics”

功能磁共振成像（fMRI）在研究大脑回路的因果关系方面具有重要价值，但受时间分辨率限制。光遗传学与fMRI和光学内在信号成像结合有助于获取有效连接数据，但植入光纤限制实验灵活性。

为克服限制，研究人员开发了一种新型混合系统，结合光学成像、模式光遗传学与全脑fMRI，采用纤维束中继方法（fiber bundle relay approach）将光刺激光束定位到目标皮质区域。这一新方法可研究活体动物全脑依赖状态的有效连接变化，增强光遗传学的灵活性和兼容性。

模式光遗传fMRI的系统开发

作者将时空灵活的皮层范围光遗传学与全脑fMRI相结合（图1A）。该光学系统分为两个空间分离的模块：（1）图案光遗传学模块，位于MRI孔外，使用数百万可编程微镜构成的DMD生成设计光场，并与sCMOS相机相结合；（2）投影模块，位于MRI孔内，包括投影透镜、直角棱镜和由MRI兼容塑料制成的3轴平移级。

两个模块通过双向转发光场的光纤束相互连接。该系统的投影模块没有在MRI图像中引入明显伪影。样品平面的视野直径约为14毫米，景深约为2.76毫米。成像和光遗传学的空间分辨率约为40微米。图案光遗传学的光学辐照度高达32 mW/mm²，足以实现深皮质层光遗传学的生理辐照度。DMD支持高达9.5 kHz的刷新率，提供亚毫秒级时间精度。该混合系统为研究大脑有效连接提供了新途径，具有很高的空间和时间分辨率。

图1. 成像的整体设计

MRI与广域光学成像的共配准

作者为小鼠（转基因或病毒介导对ChR2表达小鼠）制备了皮层范围的变薄头骨窗口，采取措施减少伪影并实现光学与MRI图像的共同配准（图2A）。研究中应用牙科树脂墙、D2O溶解的琼脂糖凝胶、填充RhB的封闭式聚乙烯管（图2B），作为核磁共振与光学图像共同注册标志。实现多空间共同注册（图2D），依据共同注册参考推导出空间变换矩阵。

通过测量25个正方形的几何中心，位移误差为35±19微米，接近系统光学分辨率（40微米）。此误差被认为可以忽略不计。最后，利用艾伦小鼠大脑连接图集（图2E）生成光刺激模式，并在结构核磁共振成像和光学反射成像上观察到良好排列的大型皮亚尔血管与光刺激模式。

图2. 核磁共振成像和光学空间坐标的共配准

模式光遗传刺激的特征

通过Monte Carlo模拟和固定小鼠大脑切片实验测量，作者研究了模式光遗传刺激下光子分布和光热效应。结果发现，光束尺寸增加会提高光穿透深度，最适合激发整个皮层的辐照度为3.6 mW/mm2（图3A-F）。

模拟和实验结果表明，模式光遗传照明引起的光热效应属于生理范围（图3G）。输入光束模式与组织深度保持一致（图3H）。光散射模糊输入模式边界，导致有效边界扩大。在3.6 mW/mm2下，2至4毫米的模式光遗传刺激可有效影响整个皮层，具有高空间特异性。

图3. 通过脑组织中的模拟和光学表征来优化模式光刺激

表达ChR2的转基因小鼠的全脑CBV加权MRI

作者验证了模式光遗传刺激是否能诱导可靠的fMRI反应。使用转基因Thy1-ChR2小鼠作为动物模型，采用脑血量加权fMRI，以提高功能敏感性和特异性。他们研究了光遗传刺激频率和持续时间的影响，并确定了适当的MRI参数。同时测试了三种不同辐照度水平，并根据结果选择了3.6 mW/mm²的辐照度。作者使用了基于图集的半随机序列中的九个刺激和恢复块，分别针对不同的皮层区域（图4A）。

结果表明模式光刺激可靠地诱发了相关ROI中CBV的增加，证实了模式光刺激的有效性（图4C）。使用一般线性模型生成组平均fMRI映射，发现fMRI响应随辐照度增加而增加（图4D-H），受刺激部位大小异质（图4F）。该方法在研究大脑活动和神经血管耦合方面具有潜力。

图4. 在氯胺酮/甲苯噻嗪(K/X)麻醉下对Thy1-ChR2小鼠进行模式化光遗传学刺激的造影剂增强CBV加权fMRI研究

有效连通性和结构连通性的全脑比较

作者通过MRI模式测量大脑区域间因果关系，并探究大规模功能网络和结构连接间关系。实验选取8只Thy1-ChR2小鼠，分析了9个皮层区域的皮层范围模式光遗传刺激的fMRI数据。研究发现，fMRI激活区域与密集轴突投影位点一致（图5A-B），同时通过EC和SC数据，发现测量的EC数据与SC数据集相似（图5F）。

实验结果表明，测量的EC在很大程度上反映了单突触轴突投影，有一些差异可能是由于SC测量的灵敏度较高所引起。

图5. 通过全脑fMRI与模式光遗传刺激与结构连接测量的有效连接

结 论

本研究提出的方法提高了MRI的灵活性和生产力，为研究全脑功能网络中动态大脑状态依赖性回路解剖或生物标志物筛选提供了新的机会。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2023.03.002

参考文献

Kim S, Moon HS, Vo TT, Kim CH, Im GH, Lee S, Choi M, Kim SG. Whole-brain mapping of effective connectivity by fMRI with cortex-wide patterned optogenetics. Neuron. 2023 Mar 24:S0896-6273(23)00170-8. doi: 10.1016/j.neuron.2023.03.002. Epub ahead of print. PMID: 37001524.