【综述】线粒体转移在缺血性卒中中的研究进展

摘要: 缺血性卒中的流行病学表现为发病率高､致死致残率高及复发率高,但目前的临床治疗方法仍存在局限性｡缺血性卒中的发生与线粒体转移密切相关｡线粒体在细胞能量供应､信号传递等方面至关重要｡近年来,将线粒体转移应用在缺血性卒中治疗的相关研究已经取得了进展｡ 作者综述了目前缺血性卒中发生后线粒体转移的相关研究,以期通过分析当下研究的不足并进行展望,为缺血性卒中临床治疗新方法的研究提供指引性帮助｡

卒中是继缺血性心脏病之后的第二大死亡病因,每年在全球造成约550万人死亡,其中缺血性卒中是发病率最高的一种卒中类型｡2019年的调查显示,我国缺血性卒中的年发病率已经达到145 例/10万人,病死率达到16%,幸存者中大约有41%的患者在5年内复发｡目前临床上常用阿替普酶静脉注射进行溶栓治疗,以改善缺血性卒中患者的神经功能预后,且根据临床治疗指南,应用此方法需要在极短的时间窗(发病后4.5h内)完成静脉注射,并具有溶栓治疗后引发脑出血的可能｡Spees等将线粒体转移定义为线粒体在细胞间的转移｡随着线粒体的动力学和其可转移能力逐渐被发掘,缺血性卒中发生后神经系统中的线粒体转移成为一个较新的研究领域,线粒体转移的相关研究进展有望成为缺血性卒中新疗法制定的重要原理与依据｡ 

1 线粒体及其转移

1.1 线粒体

作为真核细胞中最复杂和最关键的细胞器之 一,线粒体具有有氧呼吸､细胞信号转导､氧化还原平衡､氨基酸及脂质的生物转化､钙稳态的调节､细胞凋亡､细胞程序性死亡等生物过程的功能｡在线粒体进行有氧呼吸时,电子参与电子传递链,产生大量腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)｡ 然而,在缺血性卒中发生后,神经细胞在缺血､缺氧等条件下,电子泄露引起的活性氧(reactiveo xygen species,ROS)产生急剧增加,并在线粒体内聚积｡研究显示,ROS是启动线粒体自噬的初始信号之一,由ROS引发的自噬可能是检测细胞氧化还原稳态变化的机制之一｡此外,Levoux 等的研究表明,线粒体也可以促进细胞内的脂肪酸合成,从而促进受损细胞的恢复｡

线粒体的功能异常与多种疾病存在紧密关联,缺血性卒中发生的病理过程也与线粒体功能障碍密切相关｡因此,维持机体神经细胞内线粒体数量与功能稳态,对于维持神经系统的正常功能至关重要,如何在临床治疗中有效地防治线粒体功能障碍,是缺血性卒中治疗领域面临的一项极具挑战性的难题｡

1.2 线粒体转移

研究显示,线粒体积极参与了胞内运动和胞间转移｡2004年,Rustom 等首次验证了哺乳动物细胞通过隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)进行线粒体转移的现象｡2006年,Spees等对线粒体转移进行了准确定义,即完整的线粒体在细胞间转移(而不是线粒体DNA等发生转移)｡他们在实验中发现,来自人骨髓基质细胞的线粒体能够迁移到存在线粒体缺陷的A549肺癌细胞并恢复A549肺癌细胞的有氧呼吸,而并非是线粒体DNA等物质在细胞间转移而恢复细胞线粒体参与有氧呼吸的功能｡2020年,Jiang等将人间充质干细胞与角膜内皮细胞､661W细胞(一种感光细胞系)和ARPE-19细胞(一种视网膜色素上皮细胞系)共培养,再通过免疫荧光､荧光活化细胞分选及共聚焦显微镜成像和转录组分析等技术进行研究,结果显示,细胞间转移完整的线粒体,可以帮助受体细胞恢复线粒体功能｡

2  缺血性卒中发生后的线粒体转移

2.1 缺血性卒中发生后的线粒体转移概述

缺血性卒中发生后,神经系统中存在线粒体转移现象,但是目前关于缺血性卒中后发生的线粒体转移影响神经系统的机制尚不明确｡受损神经细胞所释放的线粒体出现在细胞外(图1a),一方面会使邻近的星形胶质细胞产生高效的促炎信号,促进炎性反应(图1b);或使星形胶质细胞分泌凋亡因子,促进神经细胞的凋亡(图1b)｡另一方面,受损神经细胞释放的线粒体被邻近的星形胶质细胞所吸收,成为线粒体转移的驱动因素(图1c)｡缺血性卒中发生后受到损伤的神经细胞将受损线粒体向胞外转移对于神经细胞功能的恢复是否有益目前尚无定论,有研究显示,在缺血性卒中发生后受损神经细胞释放的线粒体可以成为加剧神经细胞损伤的因素;而部分实验显示,在缺血性卒中发生后,受损神经细胞释放的线粒体与受损神经细胞产生的ROS也可作为健康线粒体向神经细胞转移的驱动因素,促进受损神经细胞的恢复｡

2.2 缺血性卒中发生后的线粒体转移机制

缺血性卒中发生后,神经细胞间线粒体转移通常有TNT､细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)､间隙连接(gap junction,GJ)等机制｡见图2｡

2.2.1 TNT:TNT是一种直径50~150nm的长距离管状结构或突起结构,依赖于细胞骨架纤维(如肌动蛋白和微管)作为支撑,在细胞间提供了细胞器和大分子物质的交流和移动通道｡

在缺血性卒中细胞模型的研究中,已经通过共聚焦显微镜､深红色分子探针染色等方法确认神经细胞间在缺血性卒中发生后通过TNT 进行线粒体转移,如Wang等､Hayakawa等分别于2011年､2016年报道在氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型中星形胶质细胞向神经细胞转移线粒体;Nasoni等于2021年报道在OGD模型中小鼠海马神经细胞间发生线粒体转移;Chakraborty等于2023 年报道在OGD 模型中发现小胶质细胞向神经细胞转移线粒体｡

2.2.2 EV:EV是一类纳米颗粒,通过供体细胞生成与受体细胞的配体受体结合､内吞和膜融合等方式,完成小分子物质､大分子物质甚至细胞器的转移｡近几年的研究显示,由细胞所形成的EV, 多按来源分为“外体”(质膜起源)和“外泌体”(内体起源)两种亚型｡实验证明,神经干细胞可以通过EV转移线粒体,并可促进神经系统疾病多发硬化症模型的小鼠康复;同时,Dave等通过OGD处理人脑微血管内皮细胞24 h,模拟遭受缺血性卒中的神经细胞,并将在OGD处理后的细胞培养基中加入分离得到的含有线粒体的EV处理24h作为24h处理组,将进行OGD处理而未加入EV的人脑微血管内皮细胞作为OGD对照组｡通过将各组细胞中ATP含量与无处理的正常人脑微血管内皮细胞中ATP含量进行对比(即为相对ATP含量)描述ATP含量和细胞活力的变化,结果显示,与OGD对照组相比,24 h处理组的相对ATP含量显著增加 [(143%±9%) 比 (27%±2%),P<0.01)]｡为了体现线粒体转移对神经系统恢复的作用,Dave 等制备了OGD 处理后再用含有线粒体的EV处理72h作为72h处理组,通过Seahorse XFe96分析仪测量细胞外酸化速率反应糖酵解能力和氧化磷酸化能力,对比72h处理组和OGD对照组,结果显示,72 h处理组显示出更高的糖酵解能力[细胞外酸化速率:(36.0±2.0)pmol/ (min·μg)比(17.0±1.0)pmol/(min·μg),P<0.01]和氧化磷酸化能力 [细胞外酸化速率:(11.0±1.0)mpH/(min·μg)比(4.0±0.5)mpH/ (min·μg), P<0.01]｡

目前缺血性卒中模型的研究已经观察到神经细胞间在缺血性卒中发生后通过EV 进行线粒体转移,如Park等､Li等于2021年报道在OGD模型中发现星形胶质细胞通过EV向神经细胞转移线粒体;Liu等2022年报道在OGD模型中发现巨噬细胞通过外泌体形式的EV向星形胶质细胞转移线粒体;Dave等于2023年报道在OGD模型中发现人脑微血管内皮细胞系细胞通过EV向原代人脑微血管内皮细胞转移线粒体｡

2.2.3 GJ:GJ是基于连接蛋白的跨膜复合物,允许细胞间进行通讯,也允许离子､小信号分子与线粒体在相邻细胞之间转移,缝隙连接蛋白43(connexin43, Cx43)是GJ形成与线粒体转移的关键蛋白｡ Islam等对骨髓基质细胞和肺泡细胞的研究显示,骨髓细胞通过基于Cx43形成的GJ附着在肺泡上,并形成TNT与EV,通过这些结构向肺泡细胞中转移线粒体｡该研究通过荧光ATP探针技术对肺泡细胞的ATP含量进行测定,结果显示,发生线粒体转移的肺泡细胞匀浆荧光强度较未发生线粒体转移的肺泡细胞显著增强[肺泡细胞ATP含量:(69±8) nmol/μg比(57±5) nmol/μg,P<0.05], 说明GJ可以显著提高肺泡细胞的ATP含量,促进肺泡细胞的功能恢复｡

目前缺血性卒中模型的研究也已经观察到神经细胞间在缺血性卒中发生后通过GJ进行线粒体转移,如Li等报道在OGD模型中发现大鼠原代星形胶质细胞中分离的线粒体借助GJ向神经细胞转移;Whisenant和Shaw报道在OGD模型中发现星形胶质细胞借助GJ向神经细胞转移线粒体｡

2.3 缺血性卒中发生后线粒体转移的调节

缺血性卒中发生后,线粒体在细胞间转移的过程受到多种相关蛋白的调节,因此针对相关蛋白与其调节作用的研究,对制定缺血性卒中发生后线粒体转移的调节方法至关重要｡

2.3.1 TNT的调节:Hayakawa等研究表明,星形胶质细胞的线粒体转移的释放过程是由涉及分化簇38(cluster of differentiation 38,CD38)和环二磷酸腺苷信号传导的钙依赖性机制介导的,星形胶质细胞可通过CD38依赖性方式支持OGD后神经细胞的存活｡

三磷酸鸟苷酶Rho1(Miro1)是一种线粒体外膜三磷酸鸟苷酶,在经由TNT的线粒体转移过程中与TNT的形成有关,Berridge等研究显示,Miro1是线粒体运输的关键物质,也是TNT形成的必需物质｡Babenko等研究显示,当星形胶质细胞受到缺血性损伤时,通过上调间充质干细胞中的Miro1表达,可使星形胶质细胞获得线粒体比例从4%提升至10%｡Wei等在实验中对进行大脑中动脉闭塞手术处理后1.5h的大鼠进行间充质干细胞+冷盐水联合治疗24h(联合治疗组),与仅进行大脑中动脉闭塞手术处理1.5h组对比,联合治疗组细胞内的Miro1表达上调[相对荧光强度:(1.20±0.05)比(0.45±0.05),P<0.01],促进了线粒体转移,导致了ROS的减少[相对ROS含量:(6.30±0.50)比(7.60±0.60), P<0.01]与ATP的增加 [细胞内ATP相对含量:(0.70±0.07) 比 (0.44±0.08), P<0.01]｡在处理24h后,通过大鼠脑的冠状切片上缺血性卒中体积的占比计算脑组织中缺血性卒中体积占比,结果显示,联合治疗组缺血性卒中体积占比显著减少 [(28%±4%)比(42%±3%), P<0.05]｡ Su等实验表明,大黄酚可以促进OGD模型中线粒体向星形胶质细胞转移,与OGD处理5h的对照组相比,在培养基中加入大黄酚(大黄酚组)促进了对神经细胞的修复功能[缺血性卒中体积占比:(20%±2%)比(50%±2%),P<0.01],及Miro1的高表达[Miro1相对含量:(174%±13%)比(66%±6%),P<0.01]。Liu等则通过实验证明,Miro1可通过将线粒体锚定在微管上来参与线粒体运输,此方式有助于提高线粒体转移效率｡因此,缺血性卒中发生后,在调控经由TNT介导的线粒体转移过程中,Miro1是一个可能的有效靶点｡

Wang等在星形胶质细胞和神经细胞间形成的TNT的神经细胞接触位点观察到了Cx43的高表达｡而在Yao等的研究中,其使用抗Cx43 的抗体(青色)固定Cx43并用荧光标记,结果显示,Cx43在TNT的形成中起关键作用,Cx43表达的增强和降低显著影响了TNT的形成｡

Wang和Gerdes的研究表明,星形胶质细胞中的TNT发育依赖于肿瘤抑制基因p53的激活｡ 在对小鼠海马神经细胞的研究中,Nasoni等的研究表明,褪黑素可以通过TNT连接促进受损的小鼠海马神经细胞之间的线粒体转移,同时褪黑素可以中和ROS,上调抗氧化酶活性并下调促氧化酶活性, 并螯合金属离子,防止电子泄漏进一步产生ROS,引发线粒体自噬｡

2.3.2 EV的调节:Park等研究表明,星形胶质细胞与神经细胞之间通过EV进行的线粒体转移过程依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/CD38/环二磷酸腺苷核糖/钙离子机制,其中CD38是一种跨膜糖蛋白,催化环二磷酸苷核糖的合成降解,也能诱导巨噬细胞的葡糖酰胺糖基化修饰,从而支持星形胶质细胞的线粒体释放｡另外,Ni等对比OGD处理4h组与OGD后使用适当浓度人参皂苷Rb1处理组发现,人参皂苷Rb1处理能阻断星形细胞产生ROS的过程,抑制还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶,阻止ROS的产生[显示ROS含量的超氧化物阴离子荧光探针的荧光强度:(0.040±0.004) 比 (0.060±0.010), P<0.05],保护功能线粒体,并促进其向神经细胞转移｡对比在小鼠脑室里注射CD38小干扰RNA敲减编码CD38蛋白组(CD38敲减组)与仅注射小干扰RNA组(对照组)发现,敲减CD38蛋白后星形胶质细胞中ROS产生量显著提升[超氧化物阴离子荧光探针的荧光强度:(0.070±0.005) 比 (0.050±0.005), P<0.05],说明在编码CD38蛋白的基因被敲减时Rb1的促进线粒体转移功能显著下降｡因此,CD38可能是调控通过EV进行的线粒体转移的一个潜在的靶点｡

此外,Liu等的研究表明,通过对比OGD处理2h组(对照组)和OGD处理后使用负载七肽的巨噬细胞衍生的外泌体(EXO-Hep)处理组(外泌体处理组)发现,负载七肽的巨噬细胞衍生外泌体通过抑制OGD后人神经母细胞瘤细胞中的Drp1/Fis1相互作用,使细胞活力显著提升(缺血性卒中体积占比:24%比66%, P<0.01),进而减少星形胶质细胞的线粒体损伤,确保健康的星形胶质细胞线粒体的释放及其随后传输到神经细胞,从而减轻由线粒体介导的神经细胞损伤｡另外,Li等用美国赛默飞世尔科技的MitoTracker Red CMXRos染剂将星形胶质细胞来源的线粒体进行免疫荧光染色,染成红色, 结果显示,与37℃培养24h对比,经过33℃以下培养24h处理后的线粒体红色荧光强度显著增加[(0.63±0.03)比(0.31±0.03), P<0.01],提示33℃以下低温处理24h可以促进线粒体通过囊泡从星形胶质细胞向受损神经细胞转移｡

2.3.3 GJ的调节:Whisenant和Shaw 研究显示,编码Cx43的基因GJA1,还可以产生长度20kD的肽,称为GJ蛋白α1截短单体-20k(GJA1-20k),这种肽可以上调星形胶质细胞中功能性Cx43表达,促进线粒体从星形胶质细胞向神经细胞的传递,GJA1-20k的缺乏则会加速Cx43蛋白的降解,抑制线粒体的转移｡

此外,Islam等研究显示,Cx43介导的GJ通过稳定间充质干细胞与受体细胞的附着,从而促进TNT和EV的形成,在线粒体转移中发挥积极作用｡ 同时,当添加间隙蛋白抑制剂GAP26以抑制Cx43时,Cx43的含量显著下降(添加GAP26后Cx43蛋白含量降至不添加GAP26对照组的74%±14%, P<0.01),GJ随后被抑制｡

3 缺血性卒中后线粒体转移治疗

线粒体移植是指将外源性功能完整的线粒体通过各种途径输注到病变部位,旨在增加病变部位线粒体数量及改善线粒体功能的新型替代疗法,基于线粒体转移的线粒体移植疗法可能是一种有效的缺血性卒中治疗方法｡

Xie等观察到,向OGD处理48h后的小鼠神经细胞干细胞培养基中加入事先从小鼠神经干细胞中分离的线粒体,与仅OGD处理对比,加入分离的线粒体促进了线粒体融合,增强了细胞活力,并减少了神经细胞中ROS的产生[反应ROS含量的荧光强度:(101.70±2.41) 比 (115.00±1.00), P<0.05]和神经细胞凋亡[神经细胞凋亡率:(23%±1%) 比 (37%±1%),P<0.01]｡Huang等通过TUNEL测定法测定OGD处理后4h的大鼠初级皮质神经细胞凋亡率,结果显示,线粒体转移降低了经过OGD处理的神经细胞凋亡[神经细胞凋亡率: (6.8%±1.1%) 比 (20.3%±3.3%), P<0.05];类似的,在经6､12hOGD处理的细胞中,线粒体转移也显著降低了神经细胞凋亡率｡

此外,在临床治疗应用方面,利用线粒体转移进行的线粒体移植疗法已经取得了进展,但尚未见利用线粒体移植治疗缺血性卒中相关研究报道｡ 2018年,Guariento等通过线粒体移植救治了10例遭受心肌缺血性损伤24h以上的患者｡其中线粒体移植组8例(8/10)和进行常规血运重建治疗的对照组4例(4/14)在治疗1周后成功脱离体外膜肺氧合(P<0.05),线粒体移植组的心室应变(即评估心脏功能的一种影像学技术,指心室在心脏周期中因压力变化而产生形变的能力)明显好于对照组(线粒体移植组心肌应变率均值:由- 6.0%变为- 23.0%,对照组心肌应变率均值:由  -7.8%变为-16.8%, P<0.01)｡

综上所述,目前的细胞实验与动物实验研究表明,线粒体转移与线粒体移植可有效减少缺血性卒中及再灌注损伤时神经细胞炎性反应､缺血性卒中灶面积及神经细胞死亡等,但尚无临床试验结果｡因此,对于缺血性卒中的治疗,探索内源性神经保护的分子机制与线粒体转移的机制并制定利用线粒体移植对缺血性卒中进行临床治疗的方法具有重要意义｡

4 不足与展望

目前缺血性卒中发生后线粒体转移的相关研究的不足主要有以下3点:

其一,缺血性卒中发生后线粒体转移的作用尚不明确｡目前在缺血性卒中发生后,线粒体转移的作用与结果,已有研究间存在相互矛盾的观点｡

其二,缺血性卒中发生后线粒体不同转移机制的调节尚不明确｡例如在对于TNT的研究中,对其形成的确切机制描述甚少;在对于EV的研究中,EV在胞外空间被受体细胞识别以及被受体细胞摄取的详细机制研究目前还处于起步阶段｡

其三,线粒体转移在临床治疗方面的研究仍不足｡在线粒体移植研究中,常用的几种分离线粒体与移植的方法(Clark和Shay的共孵育法､King和Attardi的溴化乙锭法､Macheiner等的磁-线粒体转移法､Sercel 等的压力驱动法)仍各有其局限性｡

最后,由于当前阶段缺血性卒中的临床治疗上存在方法单一且治疗“最佳时间窗”狭窄,我们希望通过对线粒体转移的深入研究,开发一种基于线粒体移植技术的缺血性卒中临床治疗方法｡因此, 后续研究一方面可着眼于缺血性卒中发生后,不同时间､不同细胞之间的线粒体转移方式与其作用机理,以对缺血性卒中发生后不同时间段干预线粒体转移的治疗效果进行探究;另一方面对线粒体转移的机制进行进一步研究,或可找寻有效的线粒体转移调节位点｡