UCLA黄昱/杨莉莉Nature Nanotechnology：氧化石墨烯抗原呈递平台仿生细胞刺激助力T细胞免疫疗法

T细胞免疫疗法

基于T细胞的免疫疗法因其在癌症治疗中的潜力而获得了相当大的关注，特别是在2017年美国食品药品监督管理局批准了第一种嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法之后。CAR T细胞治疗的成功取决于功能性T细胞的体外扩增和由T细胞激活促进的CAR工程基因的有效迁移。因此，学术界和医疗行业仍然需要寻找更加强大而有效的激活和扩增T细胞的策略。

典型的体外T细胞活化和扩增方案需要T细胞受体（TCR）刺激、配体共刺激和促生存细胞因子补充（通常是白细胞介素-2（IL-2））。目前常规的体外T细胞扩增方法使用固定在平板基质或磁性微珠（Beads^3/28、Dynabeads、Thermo Fisher）上的单克隆抗CD3（αCD3）和抗CD28（αCD28），以及外部补充的IL-2。先进的抗原呈递平台（APP）已显示出通过更好地模拟抗原呈递细胞（APC）的自然结构和功能来提高T细胞扩增效率的潜力。这些平台例子包括介孔二氧化硅纳米棒和碳纳米管-聚合物复合材料。然而，这些最先进的APP，包括Beads^3/28，具有刚性结构，限制了免疫突触中的大表面接触形成，无法完全模拟体内T细胞活化。例如，虽然体内T细胞活化可以诱导T细胞大量分泌IL-2以实现自主增殖，但当代体外APP仍需要外部IL-2补充，这突显了当前方法与通过与APC形成免疫突触实现的自然T细胞活化之间的差距。为了优化体外T细胞扩增，新型APP应该为适应性细胞表面相互作用提供实质性的表面接触和灵活性。

利用氧化石墨烯抗原提呈平台进行仿生细胞刺激

为了应对这一限制，加州大学洛杉矶分校黄昱教授和杨莉莉教授等人通过将抗体锚定在氧化石墨烯上，开发了一种柔性氧化石墨烯抗原呈递平台（GO-APP）。通过在氧化石墨烯（GO-APP^3/28）上修饰抗CD3（αCD3）和抗CD28（αCD28），研究实现了显著的T细胞增殖。GO-APP^3/28和T细胞之间的体外相互作用密切模拟了抗原呈递细胞和T细胞间的体内免疫突触。这种免疫突触模拟可改善刺激T细胞增殖的能力，同时保持多功能性和高效性。同时，它提高了CAR基因工程的效率，与标准方案相比，CAR T细胞产量增加了五倍多。值得注意的是，GO-APP^3/28刺激了T细胞中适当的自分泌白细胞介素-2（IL-2），克服了体外对外部IL-2补充的依赖，为培养独立于IL-2补充的基于T细胞的产品提供了机会。相关工作以“Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies”为题发表在Nature Nanotechnology。

【文章要点】

一、氧化石墨烯APP的设计与表征

二维材料，如氧化石墨烯，以其高柔性和巨大的表面改性潜力而闻名，是APP的理想候选者。大量的研究已经表明，纳米氧化石墨烯薄片和石墨烯量子点可以被修饰以携带药物分子或抗体。在此，作者开发了一种细胞大小的高度柔性氧化石墨烯（GO）APP（GO-APP），它通过共形接合比其他现有方法更有效地模拟体内免疫突触（图1）。具体而言，作者使用柔性聚乙二醇（PEG）连接体将αCD3和αCD28与柔性GO片结合（GO-APP^3/28）。这种设计为αCD3和αCD28的同时参与提供了广泛的界面区域和增强的可访问性，从而实现卓越的T细胞激活。研究发现，GO-APP^3/28与真正的免疫突触非常相似。天然免疫突触需要在近距离同时刺激CD3和CD28才能有效激活T细胞，这在GO-APP^3/28中得到了证实。免疫突触上高密度的结合受体有利于T细胞激活，而在GO-APP^3/28的设计中，αCD3和αCD28的密度（每个约559.32个分子/µm²GO）可适应人类生理TCR密度（每µm² 约50-570个分子），TCR激活所需的人类肽主要组织相容性复合物（pMHC）表面密度（每μm²最小90-140个分子，饱和时每μm²约500个分子），以及人类生理CD28密度（每μm² 为100-610个分子）。此外，作者还进一步优化了GO-APP^3/28的尺寸，因为接触面积起着至关重要的作用。GO-APP^3/28可提供与T细胞广泛的共形接触，从而密切反映体内APC-T细胞相互作用，并导致高效的T细胞活化。值得注意的是，T细胞和GO-APP^3/28之间的接触面积为75.82±2.59µm²。这与APC和T细胞之间的约70µm²免疫突触非常相似，并且远大于T细胞和刚性球形商业Beads^3/28之间的约2.54µm²接触面积。

图1 GO-APP的设计表征

二、T细胞的培养以及CAR T细胞的制造

随后，作者评估了GO-APP^3/28在体外激活和扩增人类T细胞的能力，并将其与Beads^3/28等进行了比较。与对照组相比，GO-APP^3/28和Beads^3/28显示出更优的T细胞活化，并且GO-APP^3/28始终优于Beads^3/28。在补充IL-2（30 U ml-1）的12天人类外周血单核细胞（PBMC）培养中，GO-APP^3/28促进了T细胞扩增的100多倍。相比之下，Beads^3/28诱导了约40倍的增加。值得注意的是，GO-APP^3/28是在不补充IL-2的情况下诱导T细胞大量扩增的唯一方法。因此，GO-APP^3/28有效地消除了T细胞活化和扩增对外部IL-2补充的体外依赖。此外，被GO-APP^3/28激活的T细胞（表示为GO-APP^3/28 T细胞）显示出更高水平的IL-2和干扰素-γ（IFN-γ）产生，以及更高的CD25表达（图2）。作者还评估了GO-APP^3/28改善CAR T细胞癌症治疗的治疗潜力。结果表明，与Beads^3/28 T细胞相比，GO-APP^3/28 T细胞在逆转录病毒和慢病毒转导方面表现出更高的转导效率，这意味着GO-APP^3/28可以提供更强的CD3和CD28刺激。最终，与Beads^3/28方法相比，GO-APP^3/28激活增强的T细胞扩增和CAR转导而导致CAR T细胞产量增加了五倍多。

图2 T细胞的培养以及CAR T细胞的制造

三、机制及抗癌治疗研究

接下来，作者对GO-APP^3/28 CAR T细胞进行肿瘤杀伤试验，以评估其在体外和体内的功能。实验表明，与Beads^3/28 CAR T组相比，GO-APP^3/28 CAR T治疗组的T细胞持久性水平更高。这些体外和体内结果突出了GO-APP^3/28 CAR T细胞在抗癌症细胞治疗中的肿瘤抑制功效和体内持久性。机制研究显示，GO-APP^3/28通过TCR/CD3、CD28和IL-2信号网络刺激T细胞活化（图3）。

图3 机制研究

【结论与展望】

总之，该研究成功开发了GO-APP，用于T细胞产品的制造。与之前使用固体表面、刚性珠、纳米棒或纳米管的方法相比，GO-APP^3/28可以在细胞大小尺度上通过共形接触更好地模拟免疫突触。因此，GO-APP^3/28可以实现高容量刺激T细胞扩增，同时保留强大的效应器功能。此外，它还使T细胞的CAR基因工程具有高效性。值得注意的是，GO-APP^3/28刺激产生了强烈的自分泌IL-2，克服了目前策略对IL-2补充的依赖性。当前GO-APP^3/28的一个潜在限制是如何与最终细胞产物分离。GO的生物相容性减轻了这种担忧，作者观察到GO-APP^3/28在体外和体内均未引起毒性，并且作者认为一种可行的分离解决方案可能是将磁性纳米颗粒掺入GO-APP^3/28。GO-APP代表了一种探索和调节细胞膜上信号蛋白相互作用的新方法，因此成功设计和优化GO-APP上抗原呈递的能力为开发用于免疫学研究和治疗应用的新型结构铺平了道路。

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