Nature Chemistry：揭示多功能周环酶LepI的催化分子机制
2019-07-24 兮 BioArt
在有机合成中，周环反应能够同时构建多个碳-碳/碳-杂原子键，并且往往具有很高的区域选择性和立体选择性。但在自然界中，催化周环反应的酶却只有少数被报道过。分支酸变位酶（chorismate mutase）、precorrin-8x甲基变位酶、SpnF和PyrI4等周环酶的结构表明自然进化出了多种可以催化[4+2]环加成反应及其他周环反应的蛋白折叠构象，并且这些结构可以调控周环反应的区域选择性和立体选
在有机合成中，周环反应能够同时构建多个碳-碳/碳-杂原子键，并且往往具有很高的区域选择性和立体选择性。但在自然界中，催化周环反应的酶却只有少数被报道过。分支酸变位酶（chorismate mutase）、precorrin-8x甲基变位酶、SpnF和PyrI4等周环酶的结构表明自然进化出了多种可以催化[4+2]环加成反应及其他周环反应的蛋白折叠构象，并且这些结构可以调控周环反应的区域选择性和立体选择性。
2017年，UCLA的唐奕教授课题组报道了一种S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的多功能周环酶LepI，它既能催化杂Diels-Alder（HDA）反应，又能催化逆Claisen重排反应6。在没有LepI存在下，化合物2可以自发脱水形成(E)-3和(Z)-4，并进一步自发发生分子内Diels-Alder反应（IMDA）或HDA反应生成一系列的环加成反应产物。而在LepI的催化下，2只能专一性地脱水形成(E)-3，并进一步发生HDA反应形成单一产物10，即Leporin C。
LepI属于O-甲基转移酶家族，但是它没有甲基转移酶活性。为什么该酶可以立体选择性地催化脱水反应、HDA反应和逆Claisen重排反应？SAM的作用又是什么？
为了回答这些问题，2019年7月21日，中国科学院上海有机化学研究所的周佳海课题组和UCLA的唐奕课题组合作在Nature Chemistry杂志上发表文章Structural Basis for Stereoselective Dehydration and Hydrogen-Bonding Catalysis by the SAM-Dependent Pericyclase LepI，解析了高分辨率的LepI及其与化合物1、8、10的复合物晶体结构，并通过与UCLA的Kendall Houk课题组合作开展理论计算工作，系统地阐释了LepI催化的分子机制。
在这些复合物结构中，化合物1是作为脱水反应的底物类似物来与LepI进行共晶实验，目的是解释立体选择性脱水反应机理；化合物10是HDA反应和逆Claisen重排反应的产物，其与LepI的复合物晶体结构可以用来比较反应前后的构象是否产生改变；exo产物8作为endo产物9的类似物，其与LepI的复合物结构可用于解释逆Claisen重排反应的机理。
LepI蛋白的母体结构通过硒原子的单波长反常散射方法被解析。在该结构中，两分子的LepI以N端结构域互相缠绕交错在一起，而C端结构域则是具有O-甲基转移酶家族典型的Rossman折叠这种超二级结构，且每分子的LepI结合一分子辅酶SAM。
突变体酶活测定实验证实了H133、R295和D296对催化活性的关键作用，结合LepI-SAM-1、LepI-SAM-8、LepI-SAM-10复合物结构以及对过渡态复合物结构的计算，该文提出LepI的催化机制很可能如下：
1. 脱水机理可能为E1-cb途径：关键残基H133作为碱，去质子化吡啶酮上的4-OH，并且稳定相应的烯醇中间体，而侧链上的羟基以反式共平面的方向离去，R295以及附近的氢键网络对此有促进作用。离开的水分子(W')可能暂时被这些残留物困住，并与碳酰胺保持氢键。LepI的脱水作用是通过将酸和碱配置在反式构型和将线型的醇底物2固定在相应的反式构象中来实现1，4-反式消除的。
2. 在HDA反应中，由于吡啶酮环上有多余的空间，所以侧链双烯可自发旋转到利于反应发生的位置。口袋周围的疏水作用和亲水作用是非对映选择性实现的关键。更重要的是，H133和R295可以作为氢键给体，起到了稳定过渡态的作用，降低了反映能垒。
3. 在之前的报道中，SAM中的正电荷对酶活十分重要，这暗示了SAM可能具有静电催化的作用。静电催化是最近被发现的一种催化方式。LepI的活性口袋是疏水的，极性较低，少数的极性残基可产生一个合适的电场，使反应物处于适宜反应发生的取向，稳定过渡态，降低能垒，促进反应的发生。虽然晶体结构中SAM与底物并没有直接接触，但是SAM上的正电荷会影响活性口袋的电场，可以推测SAM可以稳定比反应物具有更高偶极矩的过渡态。
4. 对于逆Claisen重排反应，化合物9已经处于接近NAC（near-attack conformation）的构象。将H133突变为Q或N，该反应活性大大下降，这说明H133极有可能是质子化的。结合计算，推测LepI通过H133和R295的质子化和静电作用，活化了逆Claisen重排的底物，稳定了过渡态，从而催化了该反应。
LepI-SAM-1、LepI-SAM-8和LepI-SAM-10复合物晶体结构中的活性口袋。LepI-SAM-1复合物结构中，吡啶酮上的羟基与H133有氢键作用，六元环上的氮原子和侧链上的羰基与R295、D296等残基及口袋中的水分子形成了一个氢键网络。值得注意的是，结构中的双烯侧链并没有往吡啶环方向靠近，形成易于发生DA反应的构象，而是溶剂中的甘油占据了环上方的位置。对比三个复合物晶体结构可以看出，二者吡啶酮及苯环的结合位置相同，氢键网络也大体类似，但R295的构象发生了较大的变化。
在O-甲基转移酶类家族中，存在着His-Glu催化二联体。而在LepI中，His-Glu中的His被Arg（R295）取代了。相比His，Arg是更好的氢键给体，静电稳定作用也更佳；且Arg碱性更弱，更容易停留在质子化的状态。这很可能就是LepI能催化周环反应而不是甲基转移反应的关键。
该工作不仅拓展了我们对O-甲基转移酶类家族的功能认知，也让我们对SAM的作用有了新的认识，同时也预示着SAM及依赖SAM的酶在生物新陈代谢中还有更多新的作用和功能等着科学家去发现和探索。相比有机合成中的催化剂，生物合成中的酶往往具有更高的立体专一性和催化效率。鉴于周环反应在合成领域中的重要性，对新型周环酶的发现和探索在未来生物合成以及有机合成方法中将有着巨大的潜力。
周佳海课题组的博士生蔡毓娟、唐奕课题组的博士后Yang Hai和Masao Ohashi并列论文第一作者。晶体衍射数据分别在上海光源BL17U1、BL18U1和BL19U1线站收集的。
专家点评
戈惠明（南京大学生命科学学院教授，国家优秀青年基金获得者）
周环反应是一类在反应过程中可形成环状过渡态的反应，在有机合成中具有重要的应用。在生物体中，最近也发现了一系列周环反应酶，如Claisen重排反应酶，Cope重排反应酶以及Diels-Alder反应的酶等，其中以Diels-Alder反应酶被发现的较多，研究相对透彻。在2017年，UCLA的唐奕课题组在对来源于曲霉菌的Leporin C进行生物合成研究时发现，LepI尽管被注释为一个SAM依赖的甲基转移酶，然而却发现可以同时催化脱水反应、Diels-Alder、杂Diels-Alder以及逆Claisen重排等反应，是一罕见的多功能周环反应酶。那么，功能如此多样的LepI是如何发挥催化作用的，SAM在催化过程中发挥了什么作用，活性氨基酸之间是如何协调各步反应的关系的？这些问题均尚待解答。
近日，中国科学院上海有机化学研究所的周佳海课题组和UCLA的唐奕课题组合作揭示了LepI催化的分子机制。他们通过解析脱水反应的底物类似物化合物1与LepI的共晶结构，解释了LepI立体选择性脱水的反应机理。同时，发现LepI在催化HDA的反应中，由于吡啶酮上的侧链双烯自发旋转到有利于反应发生的位置，H133和R295通过形成氢键稳定了过渡态，降低了反应能垒使得反应得以进行。通过对LepI-SAM-1的复合物晶体结构进行解析，发现SAM在反应中并没有与底物发生直接的作用而是形成一个氢键网络，通过静电催化来发挥作用。通过解析化合物8与LepI的共晶结构同时结合化学计算，确定LepI通过H133和R295的质子化和静电作用，活化了逆Claisen重排的底物，稳定了过渡态，从而催化了该反应。通过对关键催化活性氨基酸的点突变，证实推测的机制是合理的。最后作者通过将LepI与O-甲基转移酶类家族中的其它酶进行比较发现，原来的催化二联体His-Glu在LepI中进化成为Arg-Glu，这一变化使得LepI进化为一个多功能的周环反应酶。
周环反应酶由于高度的立体专一性和高效的成键方式在天然产物生物合成中有重要的作用。而LepI作为目前被报道的非常罕见的多功能周环反应酶，对其催化机制的清晰阐述为今后进一步改造和利用奠定了基础。
原始出处：
Yujuan Cai, Yang Hai, Masao Ohashi, Cooper S. Jamieson,et al.Structural basis for stereoselective dehydration and hydrogen-bonding catalysis by the SAM-dependent pericyclase LepI ,Nature Chemistry (2019) ,Published: 22 July 2019
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