Nature Methods：解码基因调控新机制：系统性发现人类转录组中的RNA结构开关

引言

RNA结构开关（RNA structural switches）是基因表达的重要调控因素，广泛存在于细菌中。然而，在真核生物中，RNA结构开关的研究和鉴定却相对有限。在细菌中，一些RNA开关被称为核糖开关（riboswitches），它们通过结合小分子配体诱导RNA构象变化，从而控制基因表达。尽管植物和真菌中已鉴定出一些硫胺素焦磷酸感应核糖开关，但在人类中已知的RNA开关仅有两个：一个是依赖于蛋白质的血管内皮生长因子A（VEGFA）RNA开关，另一个是基于m6A修饰的RNA开关。因此，RNA开关在高等真核生物基因表达中的总体影响仍不清楚。

7月16日Nature Methods的研究报道“A systematic search for RNA structural switches across the human transcriptome”介绍了SwitchSeeker，一种综合计算和实验方法，用于系统鉴定功能性RNA结构开关。研究人员将SwitchSeeker应用于人类转录组，并识别出245个潜在的RNA开关。为了验证该方法，他们在RORC（RAR-related orphan receptor C）转录本的3'非翻译区（3' UTR）中表征了一个以前未知的RNA开关。使用体内二甲基硫酸（DMS）突变谱测序（DMS-MaPseq）结合低温电子显微镜（cryo-EM）确认了其存在，并发现该RNA开关在两种不同的结构构象中表现出不同的调控功能。此外，利用基因组范围的CRISPR筛选，鉴定出通过该RNA结构开关调控基因表达的反式因子（trans factors），并发现无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）以构象特异性方式作用于该元素。

SwitchSeeker提供了一种无偏见、实验驱动的方法，用于发现塑造真核生物基因表达图景的RNA结构开关。这一研究不仅扩展了我们对RNA开关在基因调控中的理解，还为未来全面表征不同细胞类型和生物体中的RNA开关奠定了基础。

这项研究展示了RNA结构开关在基因表达调控中的重要性，并强调了开发新的RNA开关鉴定方法的必要性。SwitchSeeker作为一种迭代的预测和验证平台，通过结合计算模型和高通量实验技术，能够有效地鉴定并表征RNA开关。这一框架的应用不仅限于3' UTR，还可以扩展到其他类型的RNA开关研究中，为揭示真核生物RNA调控机制提供了新的视角。

基因表达的调控在所有生命王国中都是至关重要的过程。自从发现核糖体（ribosome）和RNA聚合酶（RNA polymerase）等分子机器以来，研究人员逐渐认识到RNA在基因调控中的核心作用。特别是一些古老的RNA调控机制，如核酶（ribozymes）和RNA结构开关，展示了RNA分子在细胞内复杂的功能。

在细菌中，核糖开关（riboswitches）通过结合小分子配体（ligands），诱导RNA构象变化，从而控制基因表达。例如，核糖开关可以感知环境中的代谢物浓度，并通过改变其二级结构（secondary structure）调控相关基因的转录或翻译。然而，在真核生物中，尽管植物和真菌中已鉴定出一些硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate）感应核糖开关，但在人类中已知的RNA开关仅有两个：一个是依赖于蛋白质的血管内皮生长因子A（VEGFA）RNA开关，另一个是基于m6A修饰的RNA开关。因此，RNA开关在高等真核生物基因表达中的总体影响仍不清楚。

SwitchSeeker：系统性鉴定RNA结构开关的方法

为了填补这一知识空白，研究团队开发了SwitchSeeker，一种综合计算和实验的方法，用于系统鉴定功能性RNA结构开关。SwitchSeeker结合了计算模型和高通量实验技术，通过迭代的预测和验证过程，有效地鉴定并表征RNA开关。

首先，研究团队开发了一种名为SwitchFinder的计算模型，该模型能够从头（de novo）预测RNA开关。SwitchFinder通过生成RNA序列的二级结构及其对应的能量景观（energy landscape），识别具有RNA开关特征的序列。这些特征包括两个局部能量最小值（local minima）和一个相对较小的能量屏障（energy barrier）。通过这种方式，SwitchFinder能够在不依赖已知序列模式的情况下，识别出新的RNA开关。

在验证SwitchFinder的性能时，研究团队将其应用于一组已知的RNA开关家族，并观察到该模型在这些家族中的预测准确性比现有的方法更高。接下来，他们将SwitchFinder与高通量实验技术相结合，创建了一个端到端的预测和验证平台，命名为SwitchSeeker。

SwitchFinder在识别人类基因组中的候选RNA开关时的结果（Credit: Nature Methods）

图a. SwitchFinder如何在VEGFA（血管内皮生长因子A）mRNA序列中定位RNA开关。示例显示了RNA开关在序列中的具体位置。

图b. SwitchFinder对常见Rfam家族RNA开关预测的ROC曲线。SwitchFinder应用于真实序列和乱序对照序列的混合物，ROC曲线衡量其正确选择真实序列的能力。结果表明，SwitchFinder在不同RNA开关家族中的预测表现良好。

图c. 比较了SwitchFinder和SwiSpot两种模型在Rfam家族中的RNA开关预测性能。每个点代表一个Rfam家族，结果显示SwitchFinder在大多数RNA开关家族中的预测准确性优于SwiSpot。

图d. 展示了SwitchFinder在各种天然和合成核糖开关（riboswitches）群体中的预测表现，包括细菌、真核和合成的核糖开关。结果表明，SwitchFinder在识别这些不同类型的核糖开关时表现出色。

在人类转录组中的应用

研究团队将SwitchSeeker应用于人类转录组，以鉴定潜在的RNA开关。首先，他们对人类转录组的3'非翻译区（3' UTR）进行了分析，选择了长度不超过186个核苷酸的3,750个候选开关元素。为了进一步筛选出在细胞中既功能性又结构上双稳态（bi-stable）的RNA开关，他们分别进行了两项高通量体内筛选实验：结构筛选和功能筛选。

结构筛选

在结构筛选中，研究团队利用DMS-MaPseq技术对表达候选RNA开关文库的HEK293细胞进行了分析。DMS-MaPseq数据中的单核苷酸可及性（accessibility）反映了多个RNA分子在Gibbs自由能景观中的不同能量最小值。如果一种构象占主导地位，它将在DMS-MaPseq反应性谱中表现出来；如果多种构象共存，它们将共同贡献于反应性谱。通过这种方法，SwitchSeeker能够识别出在体内共存于两种构象之间的RNA开关。

功能筛选

在功能筛选中，研究团队实施了大规模并行报告基因分析（MPRA），在HEK293细胞中功能性地探测RNA开关。他们将3,750个候选RNA开关序列或相应的乱序对照序列克隆到一个双荧光报告基因（eGFP-mCherry）中，使用eGFP荧光测量候选RNA开关对基因表达的影响，同时使用未受影响的mCherry荧光作为内源对照。通过流式细胞仪对按eGFP

表达比例分类的细胞进行排序和测序，研究团队发现536个候选RNA开关显著下调了eGFP的表达，538个候选RNA开关显著上调了eGFP的表达。

大规模并行报告基因分析（MPRA）在捕捉候选RNA开关不同构象之间功能差异时的结果（Credit: Nature Methods）

图a. 概述了SwitchSeeker平台在识别人类转录组中3'非翻译区（3'UTR）候选RNA开关的流程图。从人类转录组中选择出约3,750个候选RNA开关，通过结构筛选和功能筛选进一步筛选出1,454个候选RNA开关，并最终确认245个具有功能差异的双稳态结构开关。

图b. 展示了功能筛选的结果。每一行代表一个候选RNA开关，每一列代表通过报告基因表达（eGFP荧光，相对于mCherry荧光）定义的单个分类。在排序的八个分类中，展示了下调、中性和上调基因表达的候选RNA开关的相对丰度。

图c. 描述了大规模平行突变分析（MPRA）设置。对于每个候选RNA开关，设计了四个突变序列变体，其中两个锁定在构象1，另外两个锁定在构象2。通过这种方式，生成了一个序列库，每个候选RNA开关由四个突变序列变体和参考序列表示。

图d. 展示了通过MPRA确定的高置信度候选RNA开关的具体示例。底部展示了SwitchSeeker预测的两种备选构象，结合了RNA二级结构探测数据。顶部展示了候选RNA开关在不同构象锁定时对报告基因表达的影响。每一行代表一个锁定RNA开关在特定构象的序列变体，每一列代表基因表达定义的一个分类。

关键发现：RORC RNA开关

为了验证SwitchSeeker的预测，研究团队选择了位于RORC（RAR-related orphan receptor C）转录本3' UTR中的一个开关进行深入分析。通过DMS-MaPseq结构探测和单颗粒低温电子显微镜（cryo-EM），他们确认了该RNA开关在两种不同的分子构象中存在，并通过基因组范围的CRISPR干扰（CRISPRi）筛选发现其中一种构象通过激活非经典的无义介导mRNA降解（NMD）途径减少了RORC基因的表达。

研究团队设计了突变-恢复（mutation-rescue）实验，以确认RORC RNA开关的两种构象在基因表达中的不同作用。他们发现，一些突变可以稳定其中一种构象，而另一些突变则可以稳定另一种构象。例如，位于Box 1、Box 2和Box 3的突变对RORC RNA开关的结构和功能有显著影响。进一步的实验表明，这些突变在体外和体内都展示了类似的构象变化，验证了该RNA开关在不同环境中的稳定性。

通过SwitchSeeker的应用，研究团队最终报告了245个高置信度的功能性RNA结构开关。这一研究不仅扩展了我们对RNA开关在基因调控中的理解，还为未来全面表征不同细胞类型和生物体中的RNA开关奠定了基础。

SwitchSeeker作为一种迭代的预测和验证平台，通过结合计算模型和高通量实验技术，能够有效地鉴定并表征RNA开关。这一框架的应用不仅限于3' UTR，还可以扩展到其他类型的RNA开关研究中，为揭示真核生物RNA调控机制提供了新的视角。

该研究展示了RNA结构开关在基因表达调控中的重要性，并强调了开发新的RNA开关鉴定方法的必要性。未来，SwitchSeeker有望被应用于更广泛的转录组研究中，揭示更多关于RNA结构和功能的奥秘。

参考文献

Khoroshkin M, Asarnow D, Zhou S, Navickas A, Winters A, Goudreau J, Zhou SK, Yu J, Palka C, Fish L, Borah A, Yousefi K, Carpenter C, Ansel KM, Cheng Y, Gilbert LA, Goodarzi H. A systematic search for RNA structural switches across the human transcriptome. Nat Methods. 2024 Jul 16. doi: 10.1038/s41592-024-02335-1. Epub ahead of print. PMID: 39014073.

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02335-1