Nat Commun：基于单细胞、空间和原位技术对肿瘤微环境进行高分辨率分析

高通量单细胞测序实现了单个实验中数千至数百万个细胞的分析，引领了细胞分析和细胞类型鉴定的热潮。单细胞和空间技术的结合进一步颠覆了人们解析临床样本中分子状态的维度，实现了组织切片空间背景的无偏基因表达分析。但将高复杂度原位技术的数据类型与全转录组单细胞或空间数据相结合仍然是一个挑战。

癌症是一种复杂的疾病，每种肿瘤亚型都具有独特的特征和显著的细胞和分子异质性。为了更好地理解肿瘤发生和癌症生态系统，有必要在空间背景下剖析肿瘤细胞组成和分子图谱。单细胞和空间全转录组分析对癌症样本微环境的表征可谓打开了新世界的大门。

近期，10x Genomics公司团队在Nature Communications发表了题为“High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis”的文章。基于商业化的全转录组单细胞、全转录组空间和靶向原位基因表达分析技术，研究人员探索了大型FFPE人类癌症切片中的组织异质性。这种综合方法能够探索不同肿瘤区域之间的分子差异，并识别了侵袭性癌进展相关生物标志物。此外，研究人员分析了细胞邻域，并确定了位于限制恶性细胞传播的关键肌上皮边界的罕见边界细胞。该研究证明上述技术的整合可以带来对癌症更深入的见解，推动肿瘤学研究以及诊断和治疗发展。

文章发表在Nature Communications

研究人员使用单细胞、空间和原位技术对乳腺癌FFPE块的连续切片进行了研究，以探索肿瘤内的异质性（图1）。具体而言，Chromium Single Cell Gene Expression Flex（RNA模板连接（RTL）技术）（scFFPE-seq）解锁了大量样本的生物库，同时提高了敏感性。Visium CytAssist获得了完整的转录组空间数据。Xenium提供了亚细胞空间分辨率，特别适合研究导管原位癌（DCIS）中的肿瘤侵袭，因为这种肿瘤的分子复杂性高，且不同细胞类型很临近。研究人员开发的综合、多模式方法能够更深入地了解肿瘤微环境中复杂多样的细胞网络。

图1. 实验设计。

人乳腺癌FFPE组织全转录组单细胞综合图谱及空间分析

基于无监督聚类分析，scFFPE-seq数据的分析产生了17个分离良好的聚类，每个细胞鉴定的基因中位数为1480个。Visium数据产生了17个空间聚类（恰好与scFFPE-seq数据的聚类数量相同），每个点识别的基因中位数为5712个。

研究人员基于上述两个数据集和现有的人类乳腺癌参考文献，对scFFPE-seq聚类进行了注释（图2a），将细胞类型映射到Visium数据上（图2b，c）。10个Visium簇得到了注释，可以明确地分配细胞类型或疾病状态（图2b），其他7个簇的细胞类型组成是混合的。Visium精确定位了三个肿瘤结构域的空间位置，这些区域在scFFPE-seq显示为不同簇，包括两种分子上不同类型的导管原位癌，命名为DCIS#1和#2，以及侵袭性肿瘤（图2c）。Visium工作流程还描绘了免疫细胞和基质细胞的一般范围，并能够从脂肪细胞中回收转录本（图2c）。

图2. 使用全转录组单细胞和空间技术对FFPE乳腺癌样本进行表征，揭示了复杂的肿瘤和肌上皮异质性。

scFFPE-seq和Visium技术分别在单细胞水平上解决了细胞异质性并提供了空间见解。scFFPE-seq和Visium数据的整合有助于定位人类乳腺癌症组织切片中的细胞类型和转录本。但是细胞类型紧密共存的区域无法在组织内精确地进行空间分离。接下来，研究人员着手解决了在腺上皮细胞、基底膜和周围基质之间的肌上皮层中的基因表达。

Xenium原位数据分析单细胞空间分辨基因表达的肿瘤异质性

研究人员使用Xenium工作流为目标基因组生成了高分辨率基因表达数据（图3），使用了Xenium人类乳腺癌Panel（280个基因）和33个附加基因，共313个基因。将RNA荧光图像进行可视化，以高分辨率揭示组织的详细结构（图3a）。通过标准染色方案进行Xenium后H&E（图3c），能够将这些结果与病理学家的注释进行交叉参考。Xenium Explorer软件用于可视化细胞分割边界（图3d），仪器上管线输出的Xenium数据中转录本被明确分配到细胞。当把scFFPE-seq数据下采样到Xenium panel上的313个基因时，scFFPE-seq的中位数为每个细胞34个基因，Xenium数据的中位数为每个细胞62个基因（图3g，h）。

图3. Xenium数据提供了来自靶基因Panel的具有空间定位的极高分辨率的单细胞信息。

揭示肌上皮、免疫和侵袭性细胞群的异质性

研究显示，Xenium原位分析能够高灵敏度、特异性和可重复性检测RNA转录本。研究人员使用单细胞和原位数据识别了不同的肿瘤亚型，并用分子靶点补充H&E成像和病理学发现。首先，使用scFFPE-seq数据将三种不同的导管原位癌（DCIS）肿瘤上皮细胞亚型和两种肌上皮亚型映射到Xenium数据，包括三个区域（ROI）：DCIS#1、DCIS#2和侵袭性肿瘤（图4a）。scFFPE-seq数据确定了Xenium数据中ROI内15种细胞类型的比例，包括淋巴细胞、巨噬细胞、基质细胞、肌上皮细胞和侵袭性细胞，以及ROI之间细胞类型组成的四个主要差异（图4b）。最后，绘制了代表七种主要细胞类型的典型标志物的表达，以及肿瘤亚型之间差异表达的基因（图4d）。

图4. 整合scFFPE-seq和Xenium数据解读导管原位癌亚型和侵袭性肿瘤区域之间细胞类型组成和分子标记物的差异。

整合单细胞和原位数据

为了探索这种数据整合策略是否可以用于研究不同生物样本中导管原位癌向侵袭性转变。研究人员从不同的样本（样本#2）获得了人类乳腺癌症切片（注释为HER2+和ER − /PR−并包含正常、导管原位癌和侵袭区域）。利用Xenium工作流程和人类乳腺癌Panel，鉴定了免疫、肌上皮、上皮和肿瘤细胞群（图6a）。细胞类型特异性基因表达谱分析鉴定出在边界细胞中高度表达基因CX3CL1、CCL28、PROM1和KLK5（图6f）。

图5. Chromium和Xenium的整合在罕见细胞类型中发现差异表达基因。

解决肿瘤微环境的复杂性是全面了解癌症生物学所必需的。研究团队使用三种独立但互补的基因组技术探索了FFPE组织切片的生物学特性。scFFPE-seq是唯一一种以单细胞分辨率提供完整转录组数据的分析，非常适合用于建立疾病基线、注释细胞类型，并设计或验证靶向Xenium基因Panel。Xenium以高分辨率绘制关键基因的定位和表达水平的能力为转化、诊断、预测和指导更有效的治疗管理带来了巨大的希望。虽然Visium目前缺乏真正的单细胞分辨率，但它提供了完整的转录组数据以及单细胞技术无法探索的空间背景。

研究显示，与单独使用单一技术相比，三种数据的整合更严格、更精细地阐明了生物学信息。复杂组织的高分辨率原位分析加深了我们对生物学的理解，将其与成像质谱技术和CITE-seq数据进行整合可以进一步提取生物学见解。随着这些技术的不断发展，我们对分子图谱与组织结构关系的了解越来越深入，并且认识到细胞如何在其局部组织环境中与其他细胞和非细胞成分相互作用。该研究所描述的技术分辨率和广度对于转化和临床研究以及整个生物科学领域都有着积极影响。

论文原文：

Janesick, A., Shelansky, R., Gottscho, A.D. et al. High resolution mapping of the tumor microenvironment using integrated single-cell, spatial and in situ analysis. Nat Commun 14, 8353 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43458-x