中科院化学所肖海华团队《AM》：一种既能预防肿瘤转移又能精确打击原发肿瘤的PDT，有效治疗高转移性癌症

光动力疗法(PDT)作为一种新型的光介导型活性氧(ROS)癌症治疗方法，与手术、放疗、化疗等传统癌症治疗方法相比，具有治疗效率高、无耐药性、创伤小等优点。然而，氧依赖的PDT进一步加剧了肿瘤的转移。为此，中科院化学所肖海华提出了一种绕过肿瘤转移的策略，以提高PDT的治疗效果。本文合成了一种近红外光激活的光敏聚合物，并在其侧面支化了抗转移的Ru络合物NAMI-A，进一步组装形成了用于乳腺癌治疗的纳米粒子(NP2)。NP2可通过在808 nm辐射下产生ROS(NP2+L)杀死肿瘤细胞，减少癌细胞中基质金属蛋白酶(MMP2/9)的表达，降低癌细胞的侵袭和迁移能力，从而消除癌细胞。进一步的动物实验表明，NP2+L能够抑制肿瘤生长，减少肝肺转移。此外，NP2+L还可以激活小鼠的免疫系统，避免肿瘤复发。综上所述，我们开发了一种既能预防肿瘤转移又能精确打击原发肿瘤的PDT，以实现对高转移性癌症的有效治疗。该研究题为“Localization of Cancer Cells for Subsequent Robust Photodynamic Therapy by Ros Responsive Polymeric Nanoparticles with Anti-metastasis Complexes Nami-A”发表在《Advanced Materials》。

【Ru配合物及光敏剂的合成与表征】

合成光敏剂(AIE-OH)作为聚合单体。含有AIE-OH(M1)、1,2,4,5-环己烷四甲酸二酐(M2)和2,2'-(丙烷-2,2-二基双(硫烷二基))双(乙烷-)单体的生物可降解聚合物P1以mPEG_5k为封端剂，通过缩聚合成1-ol)(M3)。P1的典型特征是主链中存在AIE-OH分子和硫缩酮键，侧链中存在大量配对的羧基。AIE-OH分子的存在使P1具有显着的光动力能力，使其成为具有光动力效应的聚合物。随后，利用P1的配对羧酸，将P1与组胺缀合生成 PIM，其侧链含有丰富的咪唑。值得注意的是，含Ru的抗肿瘤药物NAMI-A近年来受到关注，并已进入II期临床试验。在这方面，该研究采用NAMI-A的药物前体Ru-DMSO与PIM侧链上的咪唑基团配位，最终产生P2。

方案1.NP2环扫原发肿瘤的原理图设计

【NP1/NP2的制备和表征】

由于其两亲特性，P1和P2可以自组装成纳米颗粒。采用P1和P2分别自组装成NP1和NP2。NP1和NP2均在水溶液中分散良好，且纳米粒子表面均带有负电荷。透射电子显微镜(TEM)分析还表明，NP1和NP2均表现出均匀且完全形成的球形结构。这些结果表明P1和P2都成功组装形成纳米颗粒，并且NAMI-A成功负载到NP2中。且NP1和NP2的光物理化学与AIE-OH相似。该研究还比较了AIE-OH、NP2和商业光敏剂ICG的ROS生成效果。实验结果表明，AIE-OH和NP2均比ICG具有更优异的ROS生成能力，并且光敏剂AIE-OH聚合形成光敏聚合物后对其光动力效应的影响可以忽略不计。此外，在H₂O₂存在下24小时，近80%的NAMI-A从NP2中释放出来。相比之下，在同一时间段内，在PBS存在的情况下，只有20%的NAMI-A从NP2中释放。上述结果表明，NP2能够在ROS存在的情况下解离并释放负载的药物NAMI-A，具有进一步应用于生命系统的潜力。

图 1. NP2 的形态特征和光动力学特性

【NP2的体外抗癌活性】

接下来，针对乳腺癌细胞系(4T1、MCF-7 和 MDA-MB-231)测试了NP2和NP2+L的抗癌活性。结果显示，NP1+L和NP2+L对乳腺癌具有优异的抗癌作用。细胞的高效摄取是NP2发挥抗癌作用的重要前提。钌是一种非生命必需元素，不存在于生命系统中，因此可以通过 ICP-MS评估细胞中吸收的NP2量。结果显示，随着处理时间的增加，4T1细胞对NAMI-A和NP2的摄取逐渐增加。这些结果表明，与NAMI-A相比，NP2更容易被癌细胞吸收。NP2在808 nm激光照射下表现出在肿瘤细胞内积累并引发大量ROS产生的能力，从而有效消灭癌细胞。值得注意的是，NAMI-A的加入增加了ROS的产生，从而增强了NP2的抗癌潜力。

图 2. NP2的细胞摄取和抗癌活性

【NP2的体外免疫激活作用】

研究报告称，PDT可以通过诱导免疫原性细胞死亡(ICD)来触发抗肿瘤免疫反应。肿瘤细胞中的ICD过程伴随着损伤相关分子模式(DAMP)的表达和释放，DAMP作为免疫原信号激活抗肿瘤免疫反应。DAMPs主要包括钙网蛋白(CRT)、ATP和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。为了研究NP2 + L是否可以诱导ICD效应，使用CLSM观察经不同药物处理的4T1细胞中CRT的分泌。结果表明，用NP2+L处理的细胞能够分泌更多的CRT并逐渐易位至细胞膜。NP2 + L促进4T1细胞中ATP的产生。此外，用NP2+L处理的细胞内的HMGB1从细胞核转移至细胞质，随后释放至细胞外区室。然而，在用NP2和NAMI-A处理的细胞中发生相对较少的HMGB1蛋白的细胞内转移，表明用NP2+L处理的细胞产生更强的ICD效应。这些结果表明NP2 + L可以显着诱导肿瘤细胞中的ICD效应，从而触发抗肿瘤免疫反应。

图 3. NP2 + L介导的免疫原性细胞死亡诱导氧化应激升高

【NP2的体外抗转移作用】

为了研究NP2+L的肿瘤抗转移活性，通过蛋白质印迹(WB)分析了不同药物处理的4T1细胞中肿瘤转移相关蛋白的表达。结果显示NP2 + L有效减少了MMP2和MMP9的细胞内表达，从而具有显着的抗转移作用。

为了进一步探讨NP2的抗转移活性，在体外研究了经各种药物处理的肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。结果显示，经NAMI-A和NP2处理后的细胞迁移能力明显受到抑制。值得指出的是，与小分子NAMI-A相比，NP2具有更强的抑制细胞迁移的能力。总之，NP2具有很强的抑制细胞迁移的能力，能够有效降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。

图4. NP2+L的体外抗转移作用

【NP2体内抗癌治疗作用】

安全性是NP2应用于体内治疗的关键因素。将健康小鼠随机分组(每组n=3只小鼠)。连续3次向小鼠尾静脉注射PBS、NAMI-A、NP1和NP2。14天后，处死小鼠，用H&E染色分析其主要器官和组织。结果表明NP1和NP2具有良好的生物安全性。为了评估NP2的体内治疗效果，该研究使用BALB/c小鼠建立了皮下乳腺癌模型。结果表明NP2具有有效的肿瘤靶向性，这也暗示NP2可能具有优异的抗肿瘤作用。随后，构建了乳腺癌4T1皮下肿瘤模型，用于研究NP2+L在14天内的体内抗肿瘤作用。再次证实了NP2 + L在肿瘤治疗中的卓越功效。

图 5. 携带4T1乳腺癌的小鼠中NP2的生物分布和NP2+L的抗癌作用

【NP2在体内激活免疫反应】

PDT诱导癌细胞中的免疫原性细胞死亡，释放肿瘤相关抗原，从而招募免疫细胞。如前所述，NP2+L可以通过诱导ICD效应来激活肿瘤部位的T细胞免疫反应，促进DC细胞成熟并通过淋巴结将抗原呈递给T细胞。为了进一步研究NP2+L对免疫系统激活的影响，取不同药物处理小鼠的肿瘤组织，考察相关免疫参数的变化。结果表明，NP2+L表现出诱导免疫原性细胞死亡(ICD)效应、触发T淋巴细胞活化并有效参与全身抗肿瘤免疫反应的能力。

图6. NP2+L触发的体内抗肿瘤免疫反应

【NP2在转移性动物模型中的治疗抗癌作用】

癌症转移仍然是癌症相关死亡率的主要原因。为了评估NP2+L介导的光动力免疫疗法在抑制肿瘤生长和转移方面的潜力，该研究开发了三阴性乳腺癌(4T1-荧光素酶)肿瘤转移模型。结果表明，用盐水和NP1治疗的小鼠表现出明显的肺肿瘤转移，导致大量死亡。相反，NAMI-A和NP2治疗减少了肺转移，但未能有效抑制肿瘤生长，导致显着的死亡率。与此形成鲜明对比的是，用NP2+L治疗的小鼠表现出对肿瘤生长的显着抑制，并且没有肿瘤转移。42天后，解剖存活的小鼠，取出肺和肝组织，观察肺转移和肝转移。结果显示，用NP2+L治疗的小鼠的肺组织重量比用其他药物治疗的小鼠低得多。此外，还量化了小鼠肝脏和肺部转移结节的数量，结果表明，用NP2+L治疗的小鼠肝脏和肺部均明显缺乏转移结节。总之，这些结果表明NP2+L在抑制三阴性乳腺癌的转移方面非常有效。肿瘤组织切片实验的结果表明，用NP2+L治疗的小鼠肿瘤组织内MMP2和MMP9的表达显着减少。MMP表达的减少可能构成观察到的肿瘤转移抑制背后的主要机制。

图7. NP2 + L在4T1-Luc乳腺癌模型中的抗转移作用

【小结】

该研究证明含有光动力聚合物和抗转移钌络合物(NAMI-A)的纳米粒子NP2可以有效抑制高度转移性乳腺癌的生长和转移。在体外，NP2在808 nm激光照射下产生ROS，有效消灭肿瘤细胞并引发免疫原性细胞死亡。同时，ROS诱导的纳米颗粒降解促进了抗转移钌复合物NAMI-A的释放。NAMI-A对癌细胞中基质金属蛋白酶MMP2/9的表达表现出显着的抑制作用，减轻其侵袭和迁移潜力。在体内，NP2+L显着抑制肿瘤生长，肿瘤抑制率高达76.9%。值得注意的是，接受NP2+L治疗的小鼠表现出极少的肝脏或肺转移病例，有效降低了肿瘤复发的可能性。此外，NP2+L激活小鼠的免疫系统，进一步增强对肿瘤复发的抵抗力。总之，抗转移钌复合物NAMI-A能够有效解决传统光动力疗法无法解决的肿瘤转移挑战，这凸显了植根于PDT的光动力纳米药物的潜力。这一突破为光动力疗法在癌症治疗中的应用开辟了新的视野。这种新颖的方法有望有效治疗高度转移的原发性肿瘤，从而增强光动力疗法在肿瘤学领域的重要性。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adma.202310298