生物样本分析法指导原则

    为了适应医药工业全球化的进展，生物样本的分析方法也需要全球化的指导原则。本文就SFDA，FDA及EMA有关生物样本分析的指导原则进行综述分析，了解其中的差异，为研究者进行生物样本分析提供参考。

        美国食品药品管理局（FDA）在2001年颁发的关于生物分析方法验证（BMV）的指导原则[1-3]。2005年SFDA颁发了三个与生物分析法相关的准则：一是关于非临床研究的，其他两个是关于临床研究的[5-7]。最近，欧洲药品管理局（EMA）发布了自己的关于BMV的草案准则[8]。这些指导原则颁布后，引起了包括EBF（欧洲生物论坛），美国药学科学家协会（AAPS）以及SBDG（上海生物分析讨论组）和BBDG（北京生物分析讨论组）在内的组织的关注。这些组织都希望建立适用于全球的统一指导原则。

        目前这些指导原则存在如下方面的不同：

1. 法规遵从

        与美国FDA的指导原则一样，中国SFDA的指导原则没有明确BMV是否必须遵循GLP规范。2003年9月以后，SFDA要求，非临床毒代动力学（TK）研究和临床BA/BE研究应分别遵守GLP和GCP规范，而对于人样本的生物分析没有规定是否仍遵循GLP规范。EMA草案明确指出，非临床试验生物样本分析无论是方法学验证还是样本测定均要遵循GLP规范，而人类生物分析研究应遵循GCP原则而不是GLP。

2. 方法验证的范围

        分析方法学的全部方法学验证的范围，SFDA、FDA和EMA的要求基本一致。对于在不同种属间进行TK研究的生物样本分析， SFDA和FDA指导原则要求在更换种属时，仅要求部分方法学验证，而EMA要求全部验证。

3. 对照和内标

        SFDA的指导原则要求在分析方法验证时应记录待测物、代谢产物及内标的信息（例如，纯度，来源和稳定性），但目前尚没有具体的质量标准要求。FDA指导原则规定了待测药物对照品的质量要求，但没有强调作为内标使用的化学品的质量要求[4]。EMA指导原则既规定了对照品的质量标准，又规定了内标的质量标准，还对内标的稳定性提出了要求[8]。

4.选择性，准确度和精密度

        SFDA指导原则对选择性、准确度和精密度的要求与FDA指导原则相似。要求在连续3天进行3个批次的总样本数不少于45个的分析测试中，考察准确度和精密度，而对于选择性没有考虑分析测试过程中代谢物转化为母药对分析的影响，而这在EMA指导原则中，这一点显得十分重要[8]。

5. 定量下限和标准曲线

        在SFDA的指导原则中生物样本分析是PK研究的一部分，LLOQ被明确定义为足够用来测定的给药后3~5个生物半衰期长的样本或者峰浓度的1 /10～1 / 20浓度。但是并没有提到对于创新药物研究中未知PK参数时如何处理。FDA指导原则规定，LLOQ至少应该满足S/N大于5，应能满足测定研究药物样本的药物浓度。EMA指导原则规定LLOQ为满足准确度和精密度要求的最低浓度。

        SFDA准则中虽然规定一个方法的标准曲线应涵盖所有浓度的研究样本，但并没有提到如何处理待测样本浓度落入校准曲线的较小范围的情况。2007进行了有关讨论并发补白皮书，建议用QC样本进行修订[5]，后者加入QC样本后重新计算标准曲线，替代原标准曲线进行样本测定。这个做法在EMA指导原则中没有提到。

6．测试物残留

        与美国FDA指导原则一样， SFDA指导原则没有涉及测试物残留的问题。由于仪器变得更加灵敏，测试物残留对色谱法（特别是浓度接近LLOQ水平时）的精密度和准确度的影响变得更大。2007年的白皮书讨论了测试物残留的来源并且进一步建议这个问题应该得到解决[5]。在这方面，EMA指导原则与2007白皮书一致。这两个文件建议以相同的方式评估测试物残留，并且指出应该避免进样序列中随机放置样本。

7. 基质效应

        SFDA指导原则对基质效应作了简单的定义并要求进行评估。然而，没有涉及进行实验的具体方法。在2007白皮书和EMA草案准则中对进行基质效应实验方法给出了综合建议，但是在SFDA指导原则中没有进行相关的更新。

8. 稳定性

        稳定性试验是方法验证中最重要的一个方面之一，在SFDA指导原则中很多问题需要明确。指导原则简单地强调，“根据具体的情况，需要进行室温放置，冷冻条件下，冻结—解冻条件下，以及不同贮藏期生物样品的稳定性研究，以确定这些样品的贮藏条件和贮藏时间。此外，需要进行储备液及处理后样本的稳定性研究。”

        然而，SFDA指导原则中缺乏如何进行这些试验的方法信息。美国FDA指导原则，2007白皮书及EMA指导原则对如何进行稳定性研究进行规定。SFDA指导原则中应该考虑引入许多美国FDA/EMA指导原则中建议的的方法。

9. 交叉验证

        交叉验证在SFDA指导原则中没有提及[11]。与FDA指导原则一样，只提到部分验证。部分验证主要用于更换实验室、校正曲线范围变化、生物基质变化，生物基质稀释液以及合并用药后选择性研究等情况下的方法学验证。这与美国FDA指导原则中的定义相同。

        2001美国FDA指导原则也定义交叉验证为“当两种或更多的生物分析方法被用于同一个或不同的研究中时，验证参数的比较”。2007白皮书中补充更换抗凝剂及种属时也可以用部分验证[11]。

        EMA指导原则明确指出，“当数据来自不同的研究地点时，需要比较这些数据，而且应对所采用的方法学进行交叉验证。”此外，它建议了进行交叉验证具体的方法，即同一套质控样品用两种分析方法分析，而且两种分析方法之间的差异不应超过15%。

参考文献：

1.Timmerman P, Lowes S, Fast DM, Garofolo F. Request for global harmonization of the guidance for bioanalytical method validation and sample analysis. Bioanalysis2(4),683 (2010).

2.Bansal S, Arnold M, Garofolo F. International harmonization of bioanalytical guidance. Bioanalysis2(4),685–687 (2010).

3.van Amsterdam P, Lausecker B, Luedtke S, Timmerman P, Brudny-Kloeppel M. Towards harmonized regulations for bioanalysis: moving forward! Bioanalysis2(4),689–690 (2010).

4.US FDA. Guidance for industry: bioanalytical method validation. US Department of Health and Human Services. US FDA CDER, MD, USA (2001).

5.Viswanathan CT, Bansal S, Booth B et al. Quantitative bioanalysis methods validation and implementation: best practices for chromatographic and ligand-binding assays. AAPS J.9(1),E30–E42 (2007).

6.Fast D, Kelley M, Viswanthan C et al. Workshop report and follow-up-AAPS workshop on current topics in GLP bioanalysis: assay reproducibility for incurred samples – implications of Crystal City recommendations. AAPS J.11(2),238–241 (2009).

7.Savoie N, Booth BP, Garofolo F et al. The 2nd calibration and validation group workshop on recent issues in good laboratory practice bioanalysis. Bioanalysis1(1),19–30 (2009).

8.European Medicine Agency. Draft Guideline on Validation of Bioanalycal Methods. EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 (2009).

9.Zhong DF. Bioanalysis in China. Bioanalysis2(2),153–156 (2010).

10.Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2010) Vol. II, Appendix XIX B. China Medical Science and Technology Press, Beijing, China (2010).

11.Smith G. Bioanalytical method validation: notable points in the 2009 draft EMA guideline and differences with the 2001 US FDA Guidance. Bioanalysis2(5),929–935 (2010).