河南工业大学张贝贝团队ACS Nano：超声激活原位疫苗增强抗原自我呈递和交叉呈递以克服癌症免疫治疗耐受

免疫检查点阻断疗法（Immune checkpoint blockade, ICB）正在彻底改变癌症治疗的格局。然而，由于肿瘤细胞不充分的抗原自我呈递和树突状细胞（Dendritic cells, DCs）无效的抗原交叉呈递，致使肿瘤细胞逃避免疫识别，无法有效激活免疫响应，最终导致ICBs治疗失败。在此，河南工业大学张贝贝团队在《ACS Nano》在线发表了题为“Ultrasound-Activatable In Situ Vaccine for Enhanced Antigen Self- and Cross-Presentation to Overcome Cancer Immunotherapy Resistance”的研究工作。该研究开发了一种超声激活的原位疫苗策略，旨在促进抗原自我呈递和抗原交叉呈递，以增强抗肿瘤免疫应答。

在本研究中，该纳米疫苗由类囊体（thylakoid, TK）/血小板（platelet, PLT）膜组成的杂化纳米囊泡（NV）和包裹DNA甲基转移酶抑制剂泽布拉林（Zebularine, Zeb）和声敏剂血卟啉单甲醚（Hematoporphyrin monomethyl ether, HMME）的脂质体所构成，称作TPLHZ。TPLHZ NVs可抑制肿瘤DNA高甲基化，增加肿瘤细胞表面MHC-Ⅰ类分子的表达，促进肿瘤细胞的抗原自递呈和免疫识别。此外，TPLHZ NVs可以通过大量生成的活性氧（Reactive oxygen, ROS）诱导死亡的肿瘤细胞原位释放肿瘤抗原，从而刺激DCs成熟并促进DCs的交叉递呈。研究结果表明，基于仿生NVs的原位肿瘤疫苗策略为提高抗PD-1耐受肿瘤的治疗效果提供了一种有前景的策略。

癌症患者HLA-I的表达水平分析和TPLHZ的物理化学表征

本研究采用生物信息学分析和免疫组化方法检测癌症患者肿瘤组织中MHC-I表达水平，结果表明对于PD-1/PD-L1阻断疗法响应率低、耐受性高的结肠癌和乳腺癌患者，MHC-I表达水平随临床进展而降低。因此，作者提出可以通过增强肿瘤细胞MHC-I的表达提高癌症免疫治疗效果。本文制备了超声响应的仿生纳米囊泡TPLHZ NVs，并对其进行了一系列表征。透射电镜分析表明所制备的TPLHZ NVs为均匀的球形，平均粒径为33.09 ± 1.37 nm。此外，连续变化的zeta电位和粒径，表明成功制备TPLHZ NVs。蛋白质印迹分析显示，与PLT膜相比，TPLHZ NVs中膜蛋白CD47、CD41和CD62p完全保留。此外TPLHZ NVs中保留有TK膜的过氧化氢酶活性，可以催化H₂O₂的迅速分解产生O₂。紫外-可见光谱证实了HMME和Zeb被成功加载到TPLHZ NVs中。最后，作者研究了TPLHZ NVs在肿瘤微环境模拟缓冲液（10 mM H₂O₂）中形态变化和药物释放能力。TEM显示，超声辐照5分钟后，TPLHZ NVs开始逐渐分解。以上结果证明超声激活的肿瘤原位疫苗体系的成功构建。

TPLHZ NVs诱导肿瘤免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death, ICD）

摄取实验表明TPLHZ NVs可以通过靶向肿瘤细胞CD44分子被摄取。在超声照射下，TPLHZ NVs处理后的4T1和CT26细胞活力明显低于游离的HMME和Zeb。进一步，通过评价ROS的产生、钙网蛋白（Calreticulin, CRT）、高迁移率族蛋白b1（High-mobility group protein b1, HMGB1）和腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine-triphosphate, ATP）的表达，揭示了TPLHZ NVs 在US激活下能够产生大量ROS诱导ICD的效应。

TPLHZ增强MHC-I分子表达，诱导DCs成熟

此外，作者通过流式细胞术和免疫荧光检测了肿瘤细胞表面MHC-I分子的表达水平，结果显示TPLHZ NVs显著增加了MHC-I的表达。接着，作者评价了TPLHZ NVs（+）处理后的4T1和CT26细胞对骨髓来源树突状细胞（Bone marrow derived dendritic cells, BMDCs）成熟的影响，流式结果显示TPLHZ（+）组MHC-II，CD40，CD80和CD86的表达均显著高于对照组，说明TPLHZ（+）可以增加垂死细胞中DAMPs的释放，促进DCs的成熟，增强DCs抗原交叉呈递。

TPLHZ NVs的体内生物分布和抗肿瘤免疫效果

活体成像数据表明，ICG标记的NVs即TK/PLT@Lipo-ICG（TPL-ICG）静脉给药后，可靶向富集于肿瘤组织，并实现血液系统的长循环。为了研究TPLHZ的抗肿瘤功效，作者将4T1荷瘤小鼠随机分为6组：PBS（G1）；PBS（+）（G2）；游离HZ（+）（G3）；PLHZ（+）（G4）；TPLHZ（G5）和TPLHZ（+）（G6）。TPLHZ（+）（G6）处理组表现出最高水平的抗肿瘤活性，治疗21天后，肿瘤体积减少了34.22%，这可归因于PLT膜的主动靶向能力和增强的ROS细胞毒性效应。同时，在为期21天的治疗干预中，体重没有统计学上的显着变化。

TPLHZ NVs抗肿瘤免疫机制分析

接着，通过流式细胞术检测了4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中MHC-I分子的表达。与游离HZ（+）组相比，PLHZ（+）和TPLHZ（+）组MHC-I分子的表达显著增加，表明PLT膜的伪装可以增强DNA甲基转移酶抑制剂Zeb在肿瘤组织中的积累，从而增强肿瘤细胞MHC-I介导的抗原呈递能力。此外，TPLHZ（+）处理后，肿瘤组织中的CD8⁺T细胞，CD4⁺T细胞及分泌颗粒酶B的CD8⁺T 细胞比例增加，同时Treg细胞比例显著下降。这些结果表明TPLHZ（+）可以刺激DCs的成熟，激活T细胞的抗肿瘤免疫效应。

TPLHZ NVs转录组测序分析

进一步地，作者通过转录组测序分析PBS和TPLHZ（+）处理后小鼠肿瘤组织中差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）的水平，结果显示DEGs上调528个，下调728个；DEGs的上调枢纽是在肿瘤特异性免疫激活中发挥关键作用的Ifng；基因本体（Gene ontology, GO）注释分析显示DEGs主要富集于免疫激活过程等相关通路；GO富集分析显示DEGs主要富集在抗原的提呈加工等相关通路。治疗过程中，所有组别小鼠未观察到体重减轻，也未观察到主要器官有明显组织学损伤，血清生化检测也无异常，说明了TPLHZ具有良好的生物安全性。作者进一步研究了TPLHZ（+）和抗PD-1抗体联合治疗的抗肿瘤活性，研究结果表明TPLHZ（+）联合抗PD-1抗体对肿瘤的抑制作用最强，肿瘤抑制率69.28%。

TPLHZ NVs抗4T1肺转移和复发的体内治疗效果

通过构建肺转移模型和再挑战模型，评价TPLHZ NVs抑制肿瘤复发和转移的能力。肺转移小鼠模型治疗后的肺组织光学照片以及H&E染色结果表明PBS组有多处转移灶，而TPLHZ（+）治疗组只观察到少量的转移灶。再挑战模型小鼠经TPLHZ（+）治疗后，原发肿瘤和再挑战肿瘤的肿瘤体积均小于PBS组。流式细胞术数据表明，TPLHZ（+）组小鼠脾脏和淋巴结中的中央记忆T细胞（T_CM，CD44⁺ CD62+ T细胞）和效应记忆T细胞（T_EM， CD44⁺ CD62⁻ T细胞）百分比明显高于对照组。总之，TPLHZ NVs可以有效地建立长期的免疫记忆，防止肿瘤的转移和复发。

【结论】

作为一种非侵入性治疗方式，超声介导的疗法由于具有良好的组织穿透性、时空选择性和无创性而具有潜在优势。大多数超声介导的疗法包括声动力疗法或超声诱导的热效应均是通过诱导肿瘤细胞的ICD，从而促进抗原交叉呈递和T细胞的免疫激活。不幸的是，超声介导的疗法很少关注到肿瘤抗原的自我呈递，而这对癌症免疫治疗同样重要。在本研究中，TPLHZ可以通过ROS爆发诱导垂死肿瘤细胞释放肿瘤抗原，这可以刺激DC成熟并促进DC的交叉呈递。此外，TPLHZ还能抑制肿瘤细胞DNA高甲基化，增加肿瘤细胞表面MHC-I分子的表达，促进肿瘤细胞抗原自我呈递和免疫识别。鉴于这些优势，将抗PD-1抗体和TPLHZ组合可有效抑制抗PD-1耐受肿瘤的生长。总之，这种超声激活的原位疫苗为克服癌症免疫治疗耐受提供了一种有希望的治疗方案。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c04045