Nature Methods：突破蛋白质功能研究瓶颈：ORFtag高效标记与筛查技术

引言

蛋白质在细胞中的各种功能执行过程中起着关键作用，系统地研究其功能对于现代生物学来说是一项重要而又复杂的任务。传统的遗传筛查方法，通过基因敲除或抑制来研究基因功能。尽管这些方法非常强大，但通常不能直接揭示蛋白质的具体功能，同时还受到功能冗余和基因必需性的限制。

为了解决这些问题，研究人员开发了基于基因功能充分性的筛选方法。这些方法通过引入开放阅读框（ORF）文库直接评估蛋白质功能。然而，现有的系统方法不仅成本高昂且难以维持，还倾向于偏向较短的ORFs（<5 kb），这是由于DNA合成、克隆、病毒包装和细胞内传递的限制造成的。

随着CRISPR-Cas9技术的发展，基因编辑和基因功能研究取得了显著进展。利用这项技术，研究人员可以精确地在基因组中特定位点引入标签或进行基因敲除，从而研究基因功能。这些技术已经成功应用于多达1300个基因的系统标记。然而，实现全基因组范围的覆盖仍然是一个巨大的挑战，因为许多基因的表达水平或基因长度限制了传统方法的适用性。

在这一背景下，ORFtag技术应运而生。ORFtag是一种创新的方法，通过使用含有启动子、选择基因、功能标签和剪接供体序列的逆转录病毒载体，实现了对内源开放阅读框（ORFs）的融合标记。ORFtag技术的多功能性、成本效益高且效率高，能够在蛋白质组范围内进行大规模平行标记和功能研究。（7月5日Nature Methods “Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag”）

具体而言，ORFtag通过大规模转染培养的细胞，使ORFtag盒随机整合到基因组中，并通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，驱动邻近内源基因座的转录，形成近N端融合蛋白。利用这种方法，研究人员能够在小鼠胚胎干细胞中进行转录激活因子、抑制因子和转录后调控因子的功能筛查。筛查可识别出新的调控因子，包括通过其他方法无法获取的长ORFs。

综上，ORFtag技术的开发和应用，代表了蛋白质功能研究领域的一次重要进步。这一方法不仅为系统地研究蛋白质功能提供了新的工具，还为未来的基因功能研究和蛋白质工程奠定了坚实的基础。通过这种创新技术，研究人员可以在大规模上进行蛋白质功能的高通量筛查，从而更全面地理解蛋白质在细胞生物学中的重要作用。

蛋白质在几乎所有细胞过程中的核心作用，使得系统地研究其功能变得至关重要。然而，现有的方法在确定蛋白质功能方面仍然面临挑战。遗传性功能缺失筛选尽管能够识别参与特定细胞过程的基因，但通常不能直接提供蛋白质功能的深入见解。此外，功能冗余和许多基因的必需性也会限制这些方法的效果。

相比之下，基于充分性的检测方法能够直接确定蛋白质的功能。然而，目前系统的方法依赖于开放阅读框文库（open reading frame libraries, ORFeomes）的传递和表达，这不仅成本高昂且难以维持，还倾向于偏向于较短的ORFs（<5 kb），这是由于DNA合成、克隆、病毒包装和细胞内传递的限制造成的。

通过工程化的本地基因位点可以克服这些限制，最近的CRISPR–Cas9技术已经能够系统地标记多达1300个基因，但实现全基因组覆盖仍然具有挑战性。

为了克服这些挑战，研究人员开发了一种名为ORFtag的创新技术。ORFtag是一种多功能、成本效益高且效率高的方法，能够在蛋白质组范围内进行大规模平行标记和功能研究。ORFtag使用含有启动子、选择基因、功能标签和剪接供体序列的逆转录病毒载体。通过大规模转染培养的细胞，ORFtag盒随机整合到基因组中，并通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，驱动邻近内源基因座的转录，形成近N端融合蛋白。

具体来说，ORFtag是基于逆转录病毒载体，这些载体包含一个启动子、一个选择基因和一个功能标签。标签后面接一个剪接供体序列。大规模转染培养的细胞后，ORFtag盒随机整合到基因组中，通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，形成近N端融合蛋白。

在该研究中，研究人员通过三种不同的筛查方法验证了ORFtag的效用：

转录激活因子筛查：将蛋白质与细菌四环素阻遏蛋白（TetR）的DNA结合域融合，使其能够招募到整合的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因上游的TetO结合位点。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出GFP表达增加的细胞，鉴定出转录激活因子。

转录抑制因子筛查：使用构建的报告基因使GFP报告基因持续活性，通过FACS筛选出GFP表达减少的细胞，鉴定出转录抑制因子。

转录后基因调控因子（PTGR）筛查：将候选ORFs与lambda噬菌体N（λN）蛋白融合，使其能够招募到在报告基因3'非翻译区（UTR）中的boxB位点。通过筛选GFP表达减少的细胞，鉴定出在转录后水平上调控GFP表达的蛋白质。

ORFtag是蛋白质组功能筛查的多功能工具（Credit: Nature Methods）

图a. ORFtag方法的总体概述。ORFtag基于逆转录病毒载体，这些载体包含一个强启动子（Pstrong）、选择基因（NeoR）和功能标签。标签后面接一个剪接供体序列。在大规模转染的细胞中，ORFtag盒随机整合到基因组中，通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，形成近N端融合蛋白。

图b. 三种不同的筛查方法。转录激活因子筛查：融合的蛋白质与TetR（细菌四环素阻遏蛋白）的DNA结合域融合，使其能够招募到TetO结合位点上游的GFP报告基因。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出GFP表达增加的细胞，鉴定出转录激活因子。转录抑制因子筛查：构建的报告基因使GFP报告基因持续活性，通过FACS筛选出GFP表达减少的细胞，鉴定出转录抑制因子。转录后基因调控因子（PTGR）筛查：候选ORFs与lambda噬菌体N（λN）蛋白融合，使其能够招募到报告基因3'非翻译区（UTR）中的boxB位点。通过筛选GFP表达减少的细胞，鉴定出在转录后水平上调控GFP表达的蛋白质。

图c. ORFtag整合位点的基因组信息，显示了在Yap1（转录激活因子）、Zfp57（转录抑制因子）和Cnot9（PTGR因子）等基因座的插入位点。结果表明，在这些基因座存在显著的筛查特异性的插入富集。

图d. 火山图（volcano plot），突出显示了已知和新发现的筛查结果。

通过这三种筛查方法，研究人员发现了显著的、筛查特异性的插入富集，例如：

转录激活因子筛查：Yap1（转录共激活因子）

转录抑制因子筛查：Zfp57（含KRAB域）

PTGR筛查：Cnot9（mRNA去腺苷化酶复合物亚基）

使用严格的阈值（FDR < 0.1%，log2比值≥1）确定了139个潜在的转录激活因子，207个抑制因子和77个PTGR蛋白。激活因子靶蛋白包括几个已知的转录激活因子，如p65、Ep300、Mediator复合物亚基和所有Kmt2(a-d)组蛋白甲基转移酶，这些因其长ORFs（长达17 kb）无法通过传统方法筛查。抑制因子靶蛋白包括75个KRAB锌指抑制因子及其共抑制因子Trim28、HP1家族蛋白、H3K9甲基转移酶和Polycomb抑制复合物组件。PTGR筛查识别出microRNA路径（Ago2、Tnrc6a/b/c）和无义介导降解路径（Smg1、Smg9、Upf2）的核心组件，以及Ccr4-Not去腺苷化复合物（Cnot2、Cnot3、Cnot9）和翻译抑制剂（Eif4e2、Eif4enif1）。

ORFtag方法在蛋白质功能研究中的高特异性（Credit: Nature Methods）

实验设计与数据分析

不同筛查结果的重叠性： 图a展示了转录激活因子（绿色）、转录抑制因子（蓝色）和转录后基因调控因子（PTGR，黄色）筛查靶蛋白的重叠性。结果显示，三种筛查的靶蛋白几乎没有重叠，表明ORFtag不导致非特异性基因的反复和人为检测。

筛查靶蛋白的功能富集： 图b显示了筛查靶蛋白在人类同源基因中的富集情况，包括DNA结合域、激活域、抑制域和RNA结合蛋白。此外，激活因子筛查靶蛋白显著富集于ORFeome激活因子，尽管重叠有限。

功能领域的富集： 图c展示了激活因子、抑制因子和PTGR筛查靶蛋白的蛋白质结构域、生物过程和细胞成分的GO富集情况。结果显示，这些基因均与其相关的功能一致，进一步验证了筛查结果的特异性。

实验验证

独立验证筛查靶蛋白： 图2d展示了对选定筛查靶蛋白的独立验证结果。通过流式细胞术检测GFP强度，结果显示所有测试候选蛋白质，包括先前未与相应生物过程相关联的靶蛋白，均能够在招募实验中验证其功能。例如：骨架蛋白Pxn或未表征蛋白1700102P08Rik的招募足以强烈激活转录。E3泛素连接酶Trim8和未表征蛋白Msantd3的招募则足以抑制转录。神经活动相关蛋白Maco1和E3泛素连接酶Trim13在招募到mRNA的3'UTR时能够抑制报告基因表达。

未表征蛋白质的细胞功能分配： 为评估ORFtag在未表征蛋白质细胞功能分配中的潜力，进一步研究了锌指蛋白Zfp574的内源功能。ORFtag筛查特异性地将Zfp574识别为转录激活因子。使用生长素诱导降解系统（AID），结果显示Zfp574的耗竭导致显著的生长缺陷，表明Zfp574对细胞适应性至关重要。快速耗竭Zfp574后进行的PRO-seq进一步揭示了Zfp574严格作为转录激活因子的作用，这与ORFtag的结果一致。通过Cut&Run技术识别了Zfp574的140个基因组结合位点，其中大多数（87.9%）位于基因转录起始位点（TSS）附近，表明Zfp574作为选择性转录激活因子，特异性地结合并激活一小部分支持细胞适应性的基因。

为了验证筛查结果，研究人员选择了每个筛查中的八个，跨越广泛的富集得分，重点是尚未证明直接功能的蛋白。通过单独克隆和转染每个筛选出的蛋白，发现所有测试的候选蛋白质，包括先前未知的调控因子，都能够在招募实验中验证其功能。例如：Pxn和1700102P08Rik蛋白质的招募足以强烈激活转录。Trim8和Msantd3的招募则足以抑制转录。Maco1和Trim13在招募到mRNA的3'UTR时能够抑制报告基因表达。

为了评估ORFtag在未表征蛋白质的细胞功能分配中的潜力，研究人员进一步研究了Zfp574的内源功能。ORFtag筛查特异性地将Zfp574识别为转录激活因子。使用生长素诱导降解系统（AID），显示Zfp574的耗竭导致显著的生长缺陷，表明Zfp574对细胞适应性至关重要。快速耗竭Zfp574后进行的PRO-seq进一步揭示了Zfp574严格作为转录激活因子的作用，这与ORFtag的结果一致。通过Cut&Run技术识别了Zfp574的140个基因组结合位点，其中大多数（87.9%）位于基因转录起始位点（TSS）附近，表明Zfp574作为选择性转录激活因子，特异性地结合并激活一小部分支持细胞适应性的基因。

ORFtag的多功能性和高效性使其成为研究蛋白质功能的一种强有力工具。通过这种创新技术，研究人员可以大规模进行蛋白质功能的高通量筛查，从而更全面地理解蛋白质在细胞生物学中的重要作用。ORFtag不仅为系统地研究蛋白质功能提供了新的工具，还为未来的基因功能研究和蛋白质工程奠定了坚实的基础。通过这种创新技术，研究人员可以更深入地了解蛋白质在细胞过程中的具体角色，从而推动生命科学研究的不断发展。

参考文献

Nemčko F, Himmelsbach M, Loubiere V, Yelagandula R, Pagani M, Fasching N, Brennecke J, Elling U, Stark A, Ameres SL. Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag. Nat Methods. 2024 Jul 5. doi: 10.1038/s41592-024-02339-x. Epub ahead of print. PMID: 38969721.

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02339-x