Nature Methods丨马涵慧组等开发出高灵敏CRISPR-Sirius染色体活细胞成像方法
2018-11-01 BioArt BioArt
人类基因组含有约30亿个DNA碱基对，细胞里的DNA大约为2米长，而细胞核的大小一般在10-20微米左右。很多年来一直困扰大家的一个问题：怎么把2米长的基因组DNA折叠组装在狭小致密的细胞核的空间里，以及基因组3D结构如何影响基因的转录和调控？在这基础上，3D结构在时间维度上的变化和对细胞命运的决定作用还有待进一步的研究。
人类基因组含有约30亿个DNA碱基对，细胞里的DNA大约为2米长，而细胞核的大小一般在10-20微米左右。很多年来一直困扰大家的一个问题：怎么把2米长的基因组DNA折叠组装在狭小致密的细胞核的空间里，以及基因组3D结构如何影响基因的转录和调控？在这基础上，3D结构在时间维度上的变化和对细胞命运的决定作用还有待进一步的研究。
染色体构象捕获（Chromosome conformation capture，简称为3C）及其衍生的方法Hi-C和高通量的DNA FISH比如庄小威实验室的MERFISH技术也正在被广泛地应用到3D基因组研究中，而这些技术主要应用在固定细胞中，产生模拟的或静态的基因组3D结构。为了研究 4D（ 第4维度为时间）基因组动态结构和功能， 基于TAL Effector或CRISPR 的成像等技术已经被用来活细胞示踪序列特异的基因组DNA， 然而要在单细胞中示踪不同的DNA元件以及DNA-DNA相互作用比如增强子和启动子的动态变化等仍然相当困难。
上海科技大学生命学院的马涵慧博士长期从事于染色体DNA活细胞示踪及其在基因组高级结构和转录调控的应用研究。马涵慧博士利用CRIPSR Cas9的同源蛋白开发了活细胞DNA标记的三色系统，成功的在单细胞中标记了多个染色体。2016年，其进一步开发了CRISPRainbow技术可以在活细胞里同时跟踪6个不同染色体 。以上系统由于受灵敏度限制只能标记基因组中非常有限的几个位点。为了跟踪每条染色体上多个不同的位点，提高示踪灵敏度已经变得非常必要。
10月30日，Nature Methods在线发表了上海科技大学的马涵慧课题组和麻省大学医学院的Thoru Pederson课题组题为CRISPR-Sirius： RNA scaffolds for signal amplification in genome imaging的研究成果。CRISPR-Sirius在保持多色，灵活性等优点的基础上，极大地提高了活细胞跟踪DNA灵敏度以及拓展了每条染色体上能被CRISPR标记的位点。马涵慧课题组于此同时和University of Central Florida的张少杰课题组合作开发了搜索工具CRISPRbar用于寻找适合于CRISPR-Sirius标记的染色体位点（http：//genome.ucf.edu/CRISPRbar/）。
马涵慧博士早期研究中发现CRISPR guide RNA在活细胞中稳定性决定了CRISPR活性，以及dCas9/sgRNA复合体在细胞核内的浓度直接决定其寻找目标DNA，进行标记或编辑的效率。本文中马涵慧课题组首先利用CRISPR-Broccoli系统在活细胞直接观察不同的位置插入RNA aptamers对guide RNA稳定性的影响，发现外源RNA aptamer插入到 tetraloop比3'-end要稳定很多，这也直接影响到DNA标记效率。
在设计CRISPR-Sirius过程中，马涵慧课题组和University of Central Florida的张少杰课题组进一步合作通过计算的方法寻找最稳定的RNA结构。这些优化后的结构可以用来同时标记一个染色体上多个位点。
进一步的研究显示CRISPR-Sirius可以用于观察在同一条染色体上从kilobase到Megabase距离的不同位点，本文以人19号染色体为例子测量了染色体多个位点之间空间距离以及它们在不同生理环境下的运动轨迹。
据悉，现阶段马涵慧课题组用CRISPR-Sirius标记了基因组中多个组织特异表达的基因来研究其DNA的表观修饰，3D基因组结构的动态变化，增强子和启动子的相互作用等在基因表达调控和细胞命运决定中的作用，并取得很好的进展。
原始出处：
Hanhui Ma, Li-Chun Tu, Ardalan Naseri, et al.CRISPR-Sirius: RNA scaffolds for signal amplification in genome imaging.Nature Methods,volume 15, pages928–931 (2018)30 October 2018
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