Nature：基于人脑DNA甲基化-染色质构象单细胞图谱，揭秘大脑发育的3D多组学动态变化

成年人的大脑包含数百种细胞类型，其在分子特征、形态、解剖结构和功能特征方面表现出丰富的多样性；大多数皮质神经元在妊娠早期和中期产生，但高度不同的细胞类型分子特征通常在妊娠晚期和青春期之间出现。近年来，单细胞和转录组分析揭示，产前晚期和产后早期发育中特征性基因表达重塑，在人脑发育过程中普遍存在的转录组动力学与DNA甲基化、染色质构象的全基因组重构相关。

已有研究表明，小鼠和人类大脑在产后早期发育过程中染色质结构发生重构，以及成人大脑区域和细胞类型中染色质构象存在广泛多样性。目前，DNA甲基化和染色质构象变化的动态轨迹尚未在产前人类脑组织中以单细胞分辨率进行表征，婴儿和成人样本之间产后发育的动态轨迹比较分析也相应缺乏。

近日，美国加州大学洛杉矶分校罗崇远博士团队及合作者在Nature发表了题为“Temporally distinct 3D multi-omic dynamics in the developing human brain”的文章。研究团队利用单核甲基化-染色质构象捕获测序技术（snm3C-seq3），绘制了超53,000个染色质构象和DNA甲基化联合单核图谱，系统探究了人类海马体（HPC）和前额叶皮层（PFC）的发育动力学。研究揭示DNA甲基化的重塑与染色质构象的动态变化在时间上是分开的；并重建了细胞类型发育和分化的调控程序，发现与精神分裂症相关的潜在致因性常见变异与染色质环连接的、细胞类型特异性的调控区域有显著重叠。综上，该研究为大脑发育中基因调控动力学提供了多维数据资源，并证明了单细胞三维多组学在剖析神经精神类疾病中的巨大应用潜力。

文章发表在Nature

主要研究内容

发育中的大脑的三维多组学

研究团队使用snm3C-seq3单细胞甲基组文库制备方法，从13个发育中和成人额叶皮层样本中生成了29,691个snm3C-seq3图谱，从9个HPC样本中生成了23,372个snm3C-seq3图谱。为对脑细胞类型进行分类，研究团队以kb分辨率量化了单个细胞中的CG和非CG甲基化以及染色质构象信息，并对其进行融合；最终确定了所有发育阶段的139个细胞亚群，这些细胞可归为10大类。

兴奋性神经元在人类PFC和HPC中具有不同的表观基因组类型，抑制性神经元和非神经元细胞类型在两个大脑区域之间广泛共享。此外，基于甲基化和染色质构象模式，神经元和神经祖细胞衍生的胶质细胞在发育阶段被显著区分开，而非神经细胞类型在整个发育过程中表现出相似的表观基因组模式。

接下来，利用细胞类型标记基因共享的CG甲基化特征模式并结合来自不同年龄组细胞的计算整合，研究团队重建了皮层和海马细胞的发育轨迹。基于DNA甲基化和染色质构象的细胞类型分类在很大程度上是一致的，在妊娠中期的大脑中存在一个明显的例外，即RG细胞可通过染色质构象细分为神经源（RG-1）亚群和假定星形胶质细胞祖细胞（RG-2）亚群。此外，神经元细胞中非CG甲基化的显著增加是神经元成熟的表观基因组标志。与PFC神经元相比，HPC兴奋性和抑制性神经元的非CG甲基化积累开始得更早。

图1. 基于snm3C-seq3分析人脑发育过程中的表观基因组和染色质构象动力学

神经元特异性染色质构象

染色质构象捕获技术可以在多个尺度上生成三维（3D）基因组结构快照，包括A区室、B区室以及染色质结构域和环等局部特征。其中，A区室和B区室是通过长程相互作用检测到，而染色质结构域和环主要是通过距离小于2Mb的短程相互作用检测到。

研究团队通过相互作用位点之间的距离分布对单细胞3C图谱进行聚类，发现聚类1-5主要包含短程染色质相互作用，聚类6-10包含大量长程染色质相互作用，其染色质接触距离分布显著不同。值得注意的是，神经元细胞类型在聚类1-6中富集，以短程相互作用为主；而胶质细胞和非神经细胞类型在聚类8-10中富集，以长程相互作用为主。

根据设定的阈值，研究团队将每个单细胞的全局染色质构象分为短程相互作用富集（SE）、长程相互作用富集（LE）和中间型（INT）。进一步分析由原代人体组织、成人人脑神经元和非神经元细胞核生成的大量Hi-C数据，发现SE是神经元细胞特异性的；神经元和星形胶质细胞的分化涉及不同的全局染色质构象重塑事件。

此外，研究团队还对发育过程中染色质区隔重构、染色质环和结构域的动力学进行了分析。结果显示，LE构象的细胞类型与更强的区域相互作用强度相关，产前发育和产后发育与不同的染色质相互作用或超相互作用启动子相关。

图2. 人类大脑发育过程中整体染色质构象的重塑

发育调控程序的动态变化

CG甲基化的差异甲基化区域（DMRs）是动态调控活性的可靠标志，研究团队通过识别所有细胞类型和发育阶段的250多万个DMRs，研究了人类皮层和海马体发育的全局调控动态、分析转录因子（TF）结合基序的富集情况，明确了跨细胞类型特定发育阶段的动态DMRs（轨迹DMRs），并区分了源自共同母细胞类型的子细胞群的 DMRs（分支DMRs）。

此外，利用TF结合基序分析，研究团队发现兴奋性和抑制性神经元的调控格局都是由谱系特异性和活性依赖性TF的顺序作用形成。在妊娠中期被激活（CG甲基化缺失）的调控元件富含谱系特异性TF的结合基序；活性依赖性TF的结合基序在兴奋性和抑制性细胞群的妊娠晚期至婴儿阶段被激活的调控元件中强烈富集。上述结果表明，妊娠晚期到婴儿早期发育阶段是表观基因组受神经元活动驱动的关键阶段。

图3. 人类大脑发育过程中调控程序的动态变化

神经精神疾病风险位点的剖析

利用上述发现的DMRs和染色质环，研究团队系统定位了神经精神疾病在不同发育阶段和细胞群中的遗传信号，使用分层连锁不平衡评分回归法对每种细胞类型中由DMRs和染色质环定义注释的多基因遗传力富集效应进行量化。与所有DMRs相比，环连接DMRs的遗传力明显更丰富，这有利于染色质环定位潜在因果变异。

研究团队还将精细映射的精神分裂症潜在因果位点与DMRs和环连接DMRs进行重叠。在190个精神分裂症精细映射位点中，分别有111个和81个位点包含至少1个与DMRs或环连接DMRs重叠的潜在因果SNP。此外，与潜在因果SNP重叠的几率和与跨细胞类型的多基因遗传力的富集之间存在较强相关性。

同时，研究团队还评估了不同神经元群体中神经精神疾病遗传力的发育动态，观察到DMRs和环连接DMRs在发育轨迹上表现出相似模式，但环连接DMRs表现出更高的总体遗传力富集。通过对所有兴奋性和抑制性人群进行荟萃分析，发现婴儿大脑中神经祖细胞和神经元对精神分裂症和双相情感障碍的富集度在发育过程中持续上升，随后在成人大脑中下降。上述结果表明，在发育中的人类大脑中，精神分裂症和躁狂症的遗传风险对有丝分裂后神经元的影响比对神经祖细胞的影响更大。

图4. 利用DMRs和染色质环定位神经精神疾病的遗传信号

结 语

研究团队分析了从妊娠中期、晚期到新生儿期中由祖细胞到神经元和神经胶质细胞群的动态转变，并利用snm3C-seq3探究了海马体与前额叶皮层发育过程中的表观基因组及三维染色质构象的重组情况，强调了snm3C-seq3基因图谱在剖析与神经精神疾病相关分子机制中的应用。研究发现人类大脑特别容易受到遗传和环境扰动的影响；DNA甲基化和染色质构象重构时间的显著分离表明，基因调控机制之间的异步性在动态生物系统（如人脑发育）中可能很常见。

论文原文：

Heffel, M.G., Zhou, J., Zhang, Y. et al. Temporally distinct 3D multi-omic dynamics in the developing human brain. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08030-7.