会发光的小鼠，速来Get它的“报告”
2024-11-05 网络 网络 发表于上海
Cre工具鼠在条件性靶基因功能研究、疾病模型研究等方面发挥了极大作用，而Cre荧光报告工具鼠作为Cre工具鼠的好搭档，又有哪些用途呢？接下来一探究竟。
首先，先来了解下什么是荧光报告工具鼠 利用基因工程技术手段，将“loxP-STOP-loxP (LSL)-Reporter gene”插入到小鼠基因组内，这样构建的小鼠模型就称为Cre报告工具鼠[1]。常见的报告基因包括β-半乳糖苷酶（lacZ）报告基因，荧光素酶（luciferase）报告基因和荧光报告基因，以荧光蛋白作为报告基因的小鼠就称为荧光报告工具鼠。常用的荧光报告基因包括绿色荧光蛋白EGFP/ZsGreen，黄色荧光蛋白EYFP，青色荧光蛋白ECFP，红色荧光蛋白mCherry/tdTomato等[2]。
图1 Cre报告工具鼠策略图[1]
当荧光报告工具鼠与Cre小鼠杂交，双阳性子代通过Cre介导的重组使得报告基因在特定细胞类群中启动表达，从而实现了细胞荧光标记和谱系追踪[3]，还可用于监测重组酶的活性和表达范围[4]。荧光报告系统已被用于检测基因编辑效果，Alapati等人使用Rosa26-mT/mG双荧光报告小鼠证明在胎儿发育过程中CRISPR-Cas9基因编辑试剂在子宫内的精确定时递送会导致胎儿肺中靶向和特异性基因编辑[5]。除此之外，Cre常与Dre工具鼠联用进行谱系追踪[6]，记录肝脏中的细胞增殖[7]，追踪癌症转移和纤维化中的EMT[8]，并阐明心脏干细胞在心脏修复过程中的作用[9]。
荧光报告工具鼠模型优势
1、自发荧光，非酶促反应：相较于荧光素酶和β-半乳糖苷酶，荧光蛋白自发荧光无需添加底物，成像简单。
2、颜色多用：有不同颜色的荧光蛋白或蛋白变体可供选择，同时显示多种细胞类型。
3、定量分析：使用荧光显微镜或流式细胞术可定量分析荧光的相对表达强度。
图2. R26R-Confetti小鼠：随机多色的Cre荧光报告鼠[3]
接下来为大家重点介绍3个集萃药康自主研发的表达单色荧光或双色荧光的Cre荧光报告工具鼠品系。
1
红色荧光报告工具鼠 T058417
H11-CAG-LSL-tdTomato
本品系在全身表达的CAG启动子后连接一个带有LSL序列的tdTomato，并将其敲入小鼠11号染色体的H11安全位点。当Cre重组酶存在时，由于loxP重组，小鼠基因组中的STOP被删除，tdTomato被表达并在光源激发下发出耀眼的红色荧光。
图3. H11-CAG-LSL-tdTomato模型策略示意图
部分验证数据展示：
图4. H11-CAG-LSL-tdTomato模型荧光成像检测
Cre-：H11-CAG-LSL-tdTomato单阳性小鼠；
Cre+：Rosa26-EIIA-iCre, H11-CAG-LSL-tdTomato 双阳性小鼠
2
绿色荧光报告工具鼠 T057823
Rosa26-CAG-LSL-EGFP-3xHA-WPRE-polyA
本品系在全身表达的CAG启动子后连接一个带有LSL序列的EGFP，并将其敲入小鼠6号染色体的Rosa26安全位点。当Cre重组酶存在时，由于loxP重组，小鼠基因组中的STOP被移除，EGFP基因表达被激活，产生绿色荧光蛋白。
图5. Rosa26-CAG-LSL-EGFP-3xHA-WPRE-polyA模型策略示意图
部分验证数据展示：
图6. Rosa26-CAG-LSL-EGFP-3xHA-WPRE-polyA模型荧光成像检测
Cre-：Rosa26-CAG-LSL-EGFP-3xHA-WPRE-polyA单阳性小鼠；
Cre+：TgTn(pb-CAG-iCre)，Rosa26-CAG-LSL-EGFP-3xHA-WPRE-polyA 双阳性小鼠
3
双色荧光报告工具鼠 T006163
H11-CAG-LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato (B6-G/R)
本品系在全身表达的CAG启动子后连接一个双荧光报告基因ZsGreen和tdTomato，并将其敲入小鼠 11号染色体的H11安全位点。当Cre重组酶存在时，由于loxP重组，小鼠基因组中的ZsGreen和STOP被移除，小鼠将由全身泛绿变色成特定组织的红光。
图7. B6-G/R模型策略示意图
部分验证数据展示：
图8. CAG-G/R模型荧光成像检测
Cre-：B6-G/R单阳性小鼠；
Cre+：Rosa26-EIIA-iCre，B6-G/R 双阳性小鼠
图9. B6-G/R模型流式细胞术分析
Cre-：B6-G/R单阳性小鼠，
Cre+：H11-Cd4-iCre，B6-G/R双阳性小鼠
相关品系：
除了上述3种荧光工具鼠，集萃药康还自主研发了多种荧光报告工具鼠，通过与Cre工具鼠杂交实现在特定细胞类型进行荧光标记和谱系追踪，更能真实反映重组酶的活性和特异性。
参考文献：
[1]Li, Siang, and Cord Brakebusch. "Reporter Mice for Gene Editing: A Key Tool for Advancing Gene Therapy of Rare Diseases." Cells 13.17 (2024): 1508.
[2]Ghim, Cheol-Min, et al. "The art of reporter proteins in science: past, present and future applications." (2010).
[3]Snippert, Hugo J., et al. "Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells." Cell 143.1 (2010): 134-144.
[4]Bittner-Eddy, Peter D., Lori A. Fischer, and Massimo Costalonga. "Cre-loxP reporter mouse reveals stochastic activity of the Foxp3 promoter." Frontiers in immunology 10 (2019): 2228.
[5]Alapati, D., et al. "In utero gene editing for monogenic lung disease. Sci Transl Med 11." (2019).
[6]Tang, Juan, et al. "Arterial Sca1+ vascular stem cells generate de novo smooth muscle for artery repair and regeneration." Cell stem cell 26.1 (2020): 81-96.
[7]He, Lingjuan, et al. "Proliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repair." Science 371.6532 (2021): eabc4346.
[8]Li, Yan, et al. "Genetic fate mapping of transient cell fate reveals N-cadherin activity and function in tumor metastasis." Developmental cell 54.5 (2020): 593-607.
[9]Li, Yan, et al. "Genetic lineage tracing of nonmyocyte population by dual recombinases." Circulation 138.8 (2018): 793-805.
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