【综述】细胞外囊泡在出血性卒中中作用的研究进展

摘要:出血性卒中主要包括蛛网膜下腔出血､脑出血,因高病死率和致残率受到广泛关注,但其病理机制及治疗靶点尚未完全明确｡近年来,细胞外囊泡因其在血管生成､抗原呈递､凋亡､凝血､细胞内稳态､炎性反应和细胞间信号转导等生物学过程中的重要作用而被广泛研究｡因为出血性卒中治疗药物需要跨血-脑屏障的特殊性,许多研究将细胞外囊泡作为一种载体来操控,使其能针对性治疗神经系统疾病｡近年来细胞外囊泡及其运载的微RNA在出血性卒中的研究方向主要为调控炎性反应及凋亡､动物模型神经保护作用､预后相关标志物的预测三个方面｡作者对细胞外囊泡的生物学功能及其在出血性卒中中的作用进行综述｡

卒中包括缺血性卒中和出血性卒中,出血性卒中指多种病因导致的原发性颅内出血性疾病,主要包括脑出血和蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)｡我国出血性卒中的发病率为69. 6 / 10万人年,约占全部卒中的28. 2%,病残率高达40%｡虽然卒中的干预和临床管理有所改善,但出血性卒中导致的继发性脑损伤使得患者的预后并未得到改善,继发性脑损伤的确切发病机制和有效治疗方式也尚未阐明｡近年来多项研究表明,细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)在出血性卒中的病理生理过程中发挥了重要的作用,可用于出血性脑损伤的治疗及预后等｡

1 EVs

EVs是经细胞分泌进入细胞外间隙､由双层磷脂包裹的囊泡｡EVs的三种主要亚型是外泌体､微粒体和凋亡小体,其形成取决于释放途径､大小､含量和功能｡EVs的内容物包括脂质､核酸和与细胞膜和脂质代谢相关的蛋白质｡EVs主要生理功能为转运核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)､蛋白质､酶和脂质｡因此EVs在血管生成､抗原呈递､凋亡､凝血､细胞内稳态､炎性反应和细胞间信号转导等生物学过程中发挥着重要作用｡

1. 1 外泌体

外泌体是多囊泡内体(内体膜向内萌发形成)与细胞膜融合后释放至细胞外的小泡,直径通常为30 ~ 150 nm,可由所有类型的细胞分泌,目前已在尿液､精液､唾液､支气管液､脑脊液､母乳､血清､羊水､滑液､眼泪､淋巴､胆汁和胃酸中发现外泌体的存在｡

大多数外泌体富含作为特异性标志物的保守蛋白,包括CD81､CD63､Alix､热休克蛋白70､融合蛋白和一些脂类相关蛋白｡外泌体在细胞交流､细胞维持､肿瘤进展和侵袭转移中发挥重要作用｡外泌体可作为抗原提呈囊泡来刺激免疫反应｡在神经系统中,外泌体有助于促进髓鞘的形成､神经突的生长和神经元的存活,从而在组织修复中发挥作用｡外泌体存在于血液和尿液等体液中,因此可通过简单的非侵入性检查,定量检测及监测患者对治疗的反应,这也使外泌体可能成为理想的生物标志物载体｡外泌体具有较长的循环半衰期,可被人体良好耐受且能够穿透细胞膜,还能靶向特定的细胞类型,因此其在免疫学应用中存在潜在价值｡

目前分离外泌体的方法有超速离心法､超滤法､聚合物沉淀法､免疫分离法等｡超速离心法是最常用的外泌体提取方法,也被认为是外泌体分离的“金标准”。此方法优点为一次可提取大量样本､成本低,缺点为处理时间长､所需设备昂贵､回收率低､纯度低,反复离心可能导致外泌体降解｡离心效果与样本中外泌体的密度有关,与外泌体的粒径和形状无关,密度差越大,分离效果越明显｡离心时间的长短也会影响分离效果。与超速离心法相比,超滤法的优势在于速度更快,无需特殊设备且易于操作,但在分离大分子量囊泡时易使其破裂变形微流控免疫分离法因其样品效率高､试剂消耗少且得到的外泌体纯度高等特点而被用于疾病诊断的研究,但此种分离方法操作复杂且需要研究人员熟练掌握微流控的试验技能｡

1. 2 微粒体

微粒体是细胞膜直接向外萌发或挤压形成的EVs,微粒体的直径通常为100 ~ 1 000 nm。微粒体组成成分目前尚未明确,但普遍认为其组成包括细胞骨架成分､肌动蛋白､肌球蛋白以及融合蛋白复合体｡微粒体的产生以及消耗数量取决于供体细胞的生理状态和微环境｡微粒体中常见的蛋白质包括胞浆和细胞膜相关蛋白､细胞骨架蛋白､热休克蛋白､整合素等｡微粒体的蛋白质组图谱因不同研究的分离方法不同而有差异,但Østergaard等在12个微粒体样本中检测到334种蛋白质,占样品中已确定蛋白质总数的63%,这表明微粒体中存在的核心蛋白组有待进一步测定｡由于微粒体由细胞膜向外出芽形成,因此微粒体缺乏经典的内体标志物,目前仍缺乏区分微粒体和外泌体的特异性标志物｡微粒体及其活性分子通过影响自噬､凋亡和炎性反应途径发挥损伤和保护受体细胞的双重作用｡微粒体的分离方法与外泌体基本一致,但各种微粒体的理化和生化性质相近,目前仍缺少能够区分细胞外基质中不同类型微粒体的分离技术｡

1. 3 凋亡小体

凋亡小体直径为50 ~ 5 000 nm,较大体积的凋亡小体更为常见｡凋亡小体的形成机制为细胞死亡收缩后静水压力增加,使细胞膜与细胞骨架分离｡凋亡小体在组成方面与外泌体有两大差异,一是凋亡小体含有完整的细胞器､染色质和少量的糖基化蛋白;二是凋亡小体和细胞裂解产物的蛋白质组图谱非常相似,外泌体则与之有明显差异｡凋亡小体的分离方法与外泌体和微粒体相近｡

2 EVs在出血性卒中的作用

目前,EVs在出血性卒中的主要研究方向为在颅内出血和SAH中的作用,其作用机制主要涉及炎性反应､凋亡等｡

2. 1 EVs在颅内出血中的作用

颅内出血发病率和病死率高,早期病死率为30% ~ 40%,多数患者在颅内出血后遗留瘫痪､失语等严重残疾｡颅内出血的原发性脑损伤主要是血肿､团块和机械损伤的影响,继发性脑损伤是导致颅内出血患者神经功能损害的关键原因,因此颅内出血治疗策略旨在限制继发性脑损伤的进展及相关并发症的出现｡有多项研究表明,EVs参与颅内出血的病理过程｡Ding等研究显示,骨髓间充质干细胞来源､携带miR-183-5p的EVs可进入糖尿病脑出血模型大鼠脑组织,通过靶向程序性细胞死亡4,抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 活化,从而改善神经功能,降低脑水肿程度,抑制炎性反应｡Duan等研究表明,富含miR -146a-5p的骨髓间充质干细胞外泌体可以通过下调白细胞介素1受体相关激酶1和活化T细胞核因子5的表达抑制小胶质细胞M1 极化,减轻神经元凋亡和炎性反应｡其中M1型小胶质细胞主要通过分泌诱导型一氧化氮合酶､肿瘤坏死因子､白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1 等促炎因子促进神经炎性反应｡Wei等的研究同样与小胶质细胞相关,颅内出血激活的小胶质细胞通过分泌外泌体将miR-383-3p转移到神经元,通过负调控转录激活因子4的表达,进而促进神经元凋亡｡Shen等发现,间充质干细胞来源的外泌体携带miR-133b,抑制Ras同源基因A的表达并激活细胞外信号调节蛋白激酶和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白抗凋亡,在颅内出血大鼠中具有神经保护作用｡Li等发现,通过中性鞘磷脂酶抑制剂(GW4849)抑制外泌体生成和释放后,神经炎性反应和颅内出血损伤明显加重,神经元损失和髓鞘损伤显著增加,脑中的葡萄糖代谢下降,血-脑屏障破坏和白细胞浸润更加明显｡将颅内出血3 d小鼠脑组织中分离出的外泌体注射到颅内出血后第1天的小鼠体内,发现颅内出血脑源性外泌体可以减少颅内出血受体小鼠的神经缺陷和白细胞浸润,同时抑制脾细胞的炎性反应活动｡Ahn等研究表明,在改善脑室出血诱导的脑损伤方面,间充质干细胞EVs与亲代间充质干细胞同样有效,而通过EVs转移的脑源性神经营养因子,可能是介导包括减轻炎性反应､凋亡､星形胶质增生及促进新生大鼠重度脑室出血后脑髓鞘形成和神经发生等有益神经保护作用的关键分泌因子｡以上研究表明,间充质干细胞外泌体可作为载体使微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)发挥其促进或抑制神经元凋亡､炎性反应等作用｡

微粒体在颅内出血领域研究较少,Dong 等通过对比86例急性基底节区出血患者与30例健康者的血浆中微粒体水平发现,出血组血浆微粒体水平与D-二聚体､C反应蛋白和纤维蛋白原增加呈正相关,多因素分析结果表明,基线血浆微粒体水平是发病后1 周死亡的良好预测因子(OR = 1. 930,95% CI:1. 229 ~ 3. 301;P = 0. 04)｡该研究并未涉及miRNA｡Walsh等前瞻性研究颅内出血后单核细胞微粒体数量变化,发现颅内出血组患者血浆中分离的促炎性单核细胞来源的微粒体数量为8. 63 ×107 / ml,而对照组为8. 64 × 107 / ml(P = 0. 525)｡然而出血组中抗炎单核细胞来源的微粒体为1.61 ×106 / ml,较对照组4. 46 × 105 / ml 明显升高(P =0.027)｡这些研究表明,在颅内出血后可能有不同种细胞释放微粒体对抗炎性反应,但目前仍不清楚微粒体的释放究竟是源于细胞的激活还是源自凋亡的细胞｡

2. 2 EVs在SAH中的作用

SAH作为发病率和病死率较高的疾病,早已引起广泛关注,其中如何减轻早期脑损伤是研究热点,但其机制尚未充分阐明,近期有研究表明EVs参与脑损伤进程｡动物实验研究表明,间充质干细胞来源的EVs产生miR-21-5p 向神经元转移,激活抑癌基因磷酸酶及张力蛋白同源物/蛋白激酶B信号通路抑制细胞凋亡,并以此来保护神经元免于凋亡,减轻SAH 诱导的认知功能障碍｡Han 等发现,间充质干细胞来源的EVs通过下调白细胞介素1β､分化簇16､分化簇11b和诱导型一氧化氮合酶以及上调分化簇206和精氨酸酶1的表达以及腺苷酸活化蛋白激酶/核因子κB通路,调控小胶质细胞向M2表型的极化｡M2 表型的小胶质细胞主要作用于吞噬细胞碎片和坏死神经元,通过释放抗炎因子减轻炎性反应,抑制神经元死亡,从而起到神经保护作用｡Qian等研究发现,间充质干细胞来源的EVs将miR-140-5p导入SAH小胶质细胞,下调激活素样激酶和还原型辅酶2的表达,从而抑制SAH小鼠M1小胶质细胞的激活,进而减少神经元凋亡和神经炎性反应｡在SAH中,EVs所释放的细胞因子数量可能不及免疫细胞,但EVs通过聚集生物因子并靶向其他细胞的功能扩大信号反应发挥其特有的作用｡目前已证实EVs与小胶质细胞､单核细胞来源的巨噬细胞和淋巴细胞相关,未来的研究可扩展至与SAH 中EVs 相关的免疫细胞,进一步阐明EVs在SAH后神经炎性反应中的作用｡Chen等通过自体动脉血注入交叉池建立实验性SAH模型,发现促进外泌体miR-124 向小胶质细胞转运,可以抑制SAH诱导的早期脑损伤潜在干预靶点重组人趋化因子分型素/ CX3C 趋化因子受体轴｡其机制为miR-124 从神经元进入小胶质细胞,调节蛋白CCAAT增强子结合蛋白α在小胶质细胞中的表达,从而抑制小胶质细胞的激活,减轻炎性反应,减轻早期脑损伤｡Lai等通过向动物模型外周注射狂犬病毒糖蛋白修饰的外泌体miR-193b-3p,发现其抑制了组蛋白脱乙酰酶3 的表达和活性,使核因子κBp65乙酰化,从而减轻炎性反应｡Cheng 等通过大鼠模型及体外SAH模型得出结论:骨髓间充质干细胞来源的外泌体转运的KLF3-AS1可通过与miR-138-5p结合而上调转录因子7 样蛋白2 表达,从而减轻SAH 后的神经功能缺陷和内皮功能障碍｡Li等通过小鼠SAH模型发现,miR-137过表达可增强内皮祖细胞外泌体对氧合血红蛋白诱导的凋亡和线粒体功能障碍的神经保护作用,外泌体miR-137的保护作用部分依赖于miR-137-环氧合酶2 /前列腺素E2通路｡Lan等测定SAH组与假手术组小鼠的EVs miRNA 发现,rno-miR-185-5p､rno-miR-103-3p､rno-miR-15b-3p､rno-miR-93-5 p 和rno-miR-9 8 -5 p为上调率高的前五名｡He等采用Meta分析方法分析近4年9项间充质干细胞和间充质干细胞来源的EVs在啮齿动物SAH模型中的作用发现,间充质干细胞来源的EVs可显著改善啮齿动物SAH模型的神经功能,减轻脑水肿｡以上动物实验表明,间充质干细胞及内皮祖细胞源性的外泌体miRNA可通过相应通路完成神经保护,降低炎性反应,但目前动物实验样本量较小,外泌体miRNA 的作用､诊断､预防和治疗潜力有待进一步研究｡在临床研究中,Liao 等通过检测未破裂或破裂动脉瘤患者以及健康人血浆外泌体miRNA表达谱发现,外泌体miR-29a-3p､miR-145-5p在颅内动脉瘤患者中高表达,进而推断循环外泌体miRNA谱可能为颅内动脉瘤的非侵袭性生物标志物,其中miR-145-5p对颅内动脉瘤破裂的预测更具意义｡Yao等前瞻性地收集了SAH患者和健康人脑脊液外泌体样本发现,白细胞介素6可能是SAH患者的早期预后的生物标志物｡

EVs在出血性卒中中作用的相关研究进展如表1所示｡

3 展望

前述研究已证实以外泌体为主的EVs在颅内出血及SAH等出血性卒中治疗及预后方面发挥重要作用｡但微粒体和凋亡小体在出血性卒中领域研究甚少,有待进一步探索｡关于外泌体的研究中,分离纯化方法仍有很大提升空间,这也是使其在实验及临床应用中进一步发挥作用的基础｡外泌体的精确靶向作用在出血性卒中治疗方面目前以动物实验为主,进一步了解其病理生理机制有广大临床应用前景｡miRNA 可以调节多条通路,许多外泌体miRNA与出血性卒中的研究中并未涉及其神经保护作用的靶点｡此外,外泌体有潜力成为疾病筛查､临床诊断､预测及预后方面的循环生物标志物,目前欠缺此类临床试验｡EVs与卒中关系的研究主要集中在缺血方面,我们期待未来能有更多的EVs与出血性卒中关系的研究｡