Nat Rev Cancer综述：环状RNA——癌症研究新前沿

RNA剪接是由剪接体核糖核蛋白复合物协调的一个基本分子过程，在多外显子基因中普遍存在。传统观点认为剪接主要涉及前mRNA中内含子的去除和外显子的连接，形成成熟的mRNA。人类剪接体由300多种蛋白质组成，其可作用于同样高度结构化的前mRNA，产生大量替代性剪接的非经典RNA。其中，环状RNA（circRNA）是目前最常见的替代性剪接RNA分子，呈连续、完美的环状，没有头部或尾部。

在过去十年间，circRNA受剪接因子突变影响并促进肿瘤发生的机制已开始被深入研究，但大多数探究癌症中circRNA作用的研究均将microRNA（miRNA）海绵化作为潜在机制，未对circRNA相关的一系列不同的功能相互作用进行深入分析。

近期，澳大利亚弗林德斯大学和美国密歇根大学的科研人员合作在Nature Reviews Cancer发表了题为“Circular RNA in cancer”的综述文章。研究团队重点介绍了circRNA与蛋白质、RNA（包括miRNA）和DNA靶点之间最具化学计量学意义的功能相互作用，这些相互作用有助于癌症的发生、促进、进展、转移和治疗耐药性。此外，文章还将讨论了如何利用circRNA作为生物标志物和/或新型治疗方法。

文章发表在Nature Reviews Cancer

1 癌症中circRNA的形成

癌症中gnohzgnehzia

在典型RNA剪接过程中，外显子以5′-3′的线性顺序连接。但circRNA是由前体mRNA（pre-mRNA）的反向剪接产生，内含子下游5'剪接位点与上游3'剪接位点连接，形成一个封闭的连续的头对尾分子（图1）；每个circRNA在连接点均会产生独特的碱基序列，称为反向剪接位点（BSJ），用于将单个circRNA映射到相应的基因组坐标。circRNA没有末端5 'cap和3 'polyA尾巴，外切酶不易接近，比线性RNA更稳定。目前，长读长测序是准确分析每个circRNA复杂性的最有效方法。

成熟的circRNA可细分为四类：①外显子circRNA（EcircRNA），仅包含单个或多个外显子，包括read-through circRNAs、f-circRNAs等；②外显子-内含子circRNA（EIciRNA），同时包含外显子和内含子；③内含子circRNA（ciRNA），其序列仅由内含子组成；④基因间circRNA，其来自编码位点以外的基因组区域，但两侧同样有GU-AG二核苷酸。上述circRNA类别具有不同的特征，含有内含子的circRNA优先保留在细胞核内，而EcircRNA则被输出到细胞质并富集在细胞质内。

有几个因素会影响pre-mRNA，使其发生反剪接从而导致circRNA的形成，包括顺式作用元件和反式作用因子。其中，顺式作用元件，包括在邻近内含子中常见的短（30-40nt）到长反向Alu元件中的互补核苷酸序列，在促进反向剪接中起着关键作用；反式作用因子包括RNA结合蛋白（RBPs），通过识别并结合pre-mRNA上的顺式作用元件，也参与circRNA的形成。

鉴于剪接因子的体细胞突变会影响RNA转录组，剪接因子的丰度和细胞类型特异性表达也会极大地影响剪接RNA转录物在肿瘤以及肿瘤微环境中的多样性。此外，RBP、基因转录和剪接位点识别之间复杂的相互作用强调了细胞中circRNA形成的复杂性及其在癌症发生、促进、进展、转移和存活中的作用。

图1. circRNA生物发生及其在癌症中的失调。

2 深入了解circRNA功能

1.亚细胞定位和核输出

circRNA通过与细胞内功能性大分子（包括RNA、蛋白质和DNA）的相互作用来发挥其功能（图2）；由于这些circRNA也可以被翻译成蛋白质，其在细胞内还具有额外的功能影响。因此，确定circRNA功能的最好策略是证明circRNA及其靶标是否在特定相互作用过程中和特定细胞类型内表现出时空共定位。常用的共定位检测技术包括单分子circRNA荧光原位杂交共定位、天然circRNA免疫沉淀和DNA-RNA免疫沉淀；最近的一种生化技术共定位交联和免疫沉淀（CoCLIP），可对RNA-蛋白质相互作用进行亚细胞分辨率研究。

一系列核蛋白和RNA运输蛋白都与circRNA的核输出有关，包括人类输出蛋白（XPO）家族中XPO1、XPO2和XPO4三种蛋白。目前已确定的circRNAs核输出策略是长度依赖性输出，由DDX39A或DDX39B分别调控短circRNAs和长circRNAs。

circRNA：靶标化学计量决定功能

circRNA的化学计量（或相对丰度）及其与靶分子（如miRNA、RBPs或其他调控分子）的相互作用，为阐明其在细胞过程中的可能功能提供了宝贵的信息。这种丰度经常被忽视，但其与共定位一样重要。

circRNA靶标（包括mRNA转录本和miRNA）在每个细胞中的丰度差异较大，分别从1到300,000个拷贝不等，以及几十到120,000个拷贝不等。相比之下，circRNA的拷贝数为1-600个/细胞，其中超90%circRNA的拷贝数少于2.5个/细胞，超99%circRNA的拷贝数少于20个/细胞。数学模型表明，为使功能性竞争性内源RNA（ceRNA）相互作用达到最优，miRNA和circRNA靶标应该以近等摩尔浓度存在。通过将这种化学计量学原理应用于circRNA-靶标相互作用，科研人员可以推断circRNA对基因调控和细胞信号通路的潜在影响。

图2. circRNA的功能和相互作用组。

miRNA海绵特性

circRNA包括多个miRNA响应元件和精氨酸蛋白（AGO）结合位点，类似于海绵吸附水（miRNA海绵），circRNA可特异性吸附miRNA，发挥竞争性内源性RNA（ceRNAs）作用。其中，AGO蛋白是RNA诱导的沉默复合体（RISC）的关键成员，可发挥miRNA的功能。

此外，尽管存在一些非典型的circRNA作为miRNA海绵的例子，如circCDR1as和circSry，其在每个circRNA分子上富集了多个响应元件，并在每个细胞环境中都有中-高度表达或在某些情况下可以稳定miRNA，但大多数circRNA的预测miRNA结合位点有限。

3 肿瘤发生中的功能性circRNA

肿瘤发生包括三个阶段：发生、促进、进展，以特征性分子和细胞事件作为标志（图3）。鉴于人们对circRNA的研究不断扩大，研究团队还纳入了其在化疗耐药性中的作用，并举例说明了circRNA在癌症中的作用以及如何利用其进行治疗。

图3. circRNA在肿瘤发生各阶段的功能作用。

1.癌症发生中的circRNA

癌基因的不可逆激活和肿瘤抑制基因的失活是驱动癌症发生的必要条件，但并非总是充分条件，这些改变可能是由各种因素引起。circRNA在引发癌症中最明确的作用是其在血液癌症中驱动致癌突变的能力。常见的基因融合事件发生在混合谱系白血病（MLL）基因与约100个伙伴基因位点之间，这被称为MLL重组组，该重组组富含产生circRNA的基因。circMLL（9,10）、来自MLL重组组伙伴基因的circRNA和其他1000多种circRNA被证明能与其同源基因组DNA位点碱基配对，在癌细胞和非癌细胞中形成 circR环。

值得注意的是，circR环可增加基因组不稳定性并驱动突变和染色体重排，产生常见、临床相关的致癌MLL基因融合，称为内源性RNA导向的DNA损伤（ER3D）。此外，另两个富集在细胞核中的circRNA，即ciankrd52和circSMARCA5，已被证明能形成circR环并影响转录和选择性剪接。

2.circRNA在癌症促进中的作用

在可逆的促进过程中，转化的细胞经历克隆扩增，并获得额外的遗传和表型变化，以促进其存活和增殖。这些变化是由表观遗传和代谢重编程、微环境因素和促进细胞增殖的选择压力等多因素复杂相互作用驱动。参与细胞代谢（例如MYC和糖酵解途径）和凋亡的基因表达或突变的改变赋予癌症细胞生长优势，使其能够战胜正常细胞。

一些circRNA具有影响癌症中细胞增殖的能力，最常见的方式是通过改变细胞代谢。已有研究在胰腺导管腺癌（PDAC）患者中发现了一种新型circRNA——circSLIT2，其在组织样本中异常过表达，并能够释放大量与细胞增殖和新陈代谢相关的主要调控因子MYC。此外，circRNA相互作用组也存在许多RNA和蛋白质成员，能够在多种癌症中共同调控MYC的表达，如circCTIC1与MYC启动子、circRHOT1与组蛋白乙酰转移酶KAT5等。

circRNA还能影响细胞凋亡，如circFOXO3、CircDONSON和CircBIRC6等。其中，circFOXO3在患者的肿瘤样本中表达量较低，但在癌症细胞凋亡过程中表达量增加。

3.circRNA在癌症进展及治疗耐药性中的作用

血管生成拟态（VM）是一种全新的肿瘤血管模式，能够形成血管样网络而无需内皮细胞参与并且不依赖血管生成；这是癌症的一个关键特征，可为肿瘤的生长提供养分和氧气。已有研究表明，有一系列circRNAs与VM相关，如circSHKBP1和circSMARCA5等。

circRNA还能促进肿瘤转移。肿瘤转移是肿瘤恶性化发展的重要环节，其主要驱动因素包括上皮间质转化（EMT）、与宿主免疫系统的相互作用等。对人乳腺上皮细胞系EMT期间circRNA的分析显示，超4,500个circRNA在过渡到间充质状态时特异表达；结直肠癌中的circITGB6、PDAC中circIARS以及人类胃癌组织中的circUR1等均能促进肿瘤转移。转移中这种广泛的功能性circRNA模式表明，通过治疗性靶向circRNA来限制转移可能具有潜力。

精准医疗、免疫治疗和靶向治疗的进步显著改善了许多癌症患者的预后，使其能够实现持久的应答和长期的生存。但CircSORE、 circCREIT、circE-cadherin和circ_0085616等circRNAs可增强肿瘤耐药性，目前已成为化疗和放疗成功治疗的主要障碍。

4 circRNA的临床应用

1.circRNA作为生物标志物

circRNA是共价闭合结构，具有较长的半衰期和细胞类型特异性，已成为癌症诊断和治疗反应的潜在治疗靶点和生物标志物。检测患者血浆和血液中的circRNA可实现早期疾病检测，尤其是对于PDAC和胶质母细胞瘤等通常需要晚期诊断的癌症。

已有开创性研究对超2,000个患者（共22种癌症亚型）样本中circRNA进行了分析，构建了一个名为MiOncoCirc的资源数据库。最近一个包含五种circRNA的panel被用于筛查血浆样本，成功识别了PDAC患者并区分疾病分期。

尽管已有大量研究将circRNAs作为多种癌症的潜在生物标志物，但目前仍有一些局限阻碍了其临床应用。如circRNA表现出细胞类型特异性表达，但理想的circRNA肿瘤生物标志物应该仅在肿瘤中表达；一些较小且异质性的肿瘤可能无法产生足够的circRNA，使用常规检测方法（如PCR）无法检测到，需要灵敏度且成本更高的方法。

2.circRNA的治疗应用

靶向或利用癌症中的circRNA可能是一种有效的治疗方法。为将circRNA作为治疗载体并使患者受益，其需满足以下条件：（i）治疗反应必须长期持续；（ii）必须优化circRNA治疗剂包装和向癌细胞的靶向递送；（iii）必须减轻单个circRNA的多效性影响。特别地，注射大剂量基于circRNA的疫苗可能会弥补天然细胞环境中的不足；在这种环境下，高丰度靶点与传统低表达circRNA之间存在配比不足，能够扩大疫苗在体内的有效性。

无论如何，为实现circRNA的临床转化，目前亟需采用更深入的系统生物学方法来研究细胞内源性circRNA的功能并优化治疗干预。

5 结论与观点

综上所述，circRNA是肿瘤发生每个阶段的关键功能介质，将这些发现转化到临床需要进一步的努力和投入。虽然circRNA的功能是由其相互作用组决定的，但在分析其功能时，必须更多地考虑circRNA及其靶标的配比和位置。circRNA作为液体生物标志物对难以检测的癌症、活检禁忌的癌症或跟踪肿瘤进展（如脑癌）有积极的贡献，并可作为癌基因或肿瘤抑制因子。综上，circRNA在改善治疗反应和存活率方面具有巨大潜力。

参考来源：

Conn, V.M., Chinnaiyan, A.M. & Conn, S.J. Circular RNA in cancer. Nat Rev Cancer 24, 597–613 (2024). 

https://www.nature.com/articles/s41568-024-00721-7