​异基因“现货型”CAR-T的机会和挑战

CAR-T 细胞疗法在 B 细胞恶性肿瘤和多发性骨髓瘤中显示出令人印象深刻的临床疗效，但这些自体（患者来源）CAR-T细胞的广泛应用受到多个因素的限制，包括生产成本高、产品质量不一致、恶性细胞污染细胞产品、制备失败（尤其是重度经治患者中）以及制备时间过长（2周左右）导致后续治疗延迟等。这些障碍的潜在解决方案包括使用从健康供者生产的异基因“现货型”CAR-T细胞，有可能降低生产成本、增加产品的一致性、实现标准化制备并避免治疗延迟。许多学者正在进行探索，旨在使异基因 CAR-T 细胞成为安全有效的治疗选择。

但异基因CAR-T也存在挑战，特别是移植物抗宿主病 (GVHD) 和宿主介导的供者细胞免疫排斥。学者正在研究克服这些限制的方法，重点关注基因编辑技术的使用和使用替代细胞群作为异基因 CAR-T 细胞制备来源。

存在的挑战

尽管有许多潜在获益，但使用异基因 CAR-T 细胞开发安全有效的治疗选择还需要应对多个挑战。与异基因 CAR-T 细胞治疗相关的最大障碍在于供者和受者之间免疫差异的结果。异基因 T 细胞可将受者细胞上的抗原识别为外来物并攻击受者组织，简称移植物抗宿主病 (GVHD)。而受者的免疫系统可以将异基因 T 细胞产物识别为外来物并排斥，导致 CAR-T 细胞扩增/持久性有限，随后降低抗肿瘤疗效。CAR-T细胞输注前通常需要进行清淋化疗，以改善 CAR-T 细胞的植入、长期生存和疗效，但预处理方案也可导致显著的副作用，包括感染。

移植物抗宿主病

异基因 T 细胞过继转移具有 GVHD 风险，这在异基因造血细胞移植 (allo-HCT) 背景下经常观察到。GVHD是一种可能危及生命的并发症，表现为主要累及皮肤、胃肠道和肝脏的组织炎症（急性GVHD）和/或可累及任何器官系统（包括眼、口、关节和生殖道）的纤维化（慢性GVHD）。当具有免疫活性的供者 T 细胞将受者抗原识别为外源抗原并触发免疫应答，导致受者组织被破坏时，就会发生GVHD。该识别可直接靶向宿主主要组织相容性复合体 (MHC)（人类白细胞抗原[HLA]）、宿主次要组织相容性抗原 (mHAgs) ，或两者。

宿主介导的免疫排斥

CAR-T 细胞的体内扩增和长期持续性与持续临床缓解相关，但异基因 CAR-T 细胞经常受到宿主介导的免疫排斥反应的影响。与 allo-HCT 相似，宿主和受者 HLA 和 mHAgs 的差异也可能导致异基因 CAR-T 细胞的排斥。受者免疫细胞可以以 HLA/mHAg 介导的方式将 CAR 构建体本身或异基因细胞识别为外源，启动免疫应答，导致拒绝异基因 CAR-T 细胞，表现为持久性降低和抗肿瘤疗效降低。但还需要对 HLA 和 mHAgs 差异的相关性和具体作用进行详细研究。在接受 HLA 不全相合 allo-HCT 并随后接受来源于原始供者的异基因 CAR-T 细胞的患者中，可能会出现特殊的挑战。预形成的供者特异性抗 HLA 抗体 (DSAs) 可引起供者来源的异基因 CAR-T 细胞的快速消除，简称同种免疫（alloimmunization）。

目前的进展

开发异基因 CAR-T 细胞疗法的最终目标是能够建立冻存细胞库，该细胞库含有可供多名患者使用的健康供者生产的细胞。目前的进展见图1，主要关注克服HLA 差异导致的GVHD 和宿主介导的免疫排斥，手段包括使用基因编辑技术和使用替代细胞群作为异基因 CAR 细胞生成的来源。

此外，临床可耐受的 HLA 错配可能会增加异基因 CAR-T 细胞的合适供者数量，而不会增加 GVHD 或宿主介导的免疫排斥风险。表1总结了目前评价异基因 CAR-T 细胞产品的已发表临床试验或中期结果。

基因编辑

基因编辑是一种广泛使用的策略，分别通过破坏T细胞受者 (TCR) 或 HLA 分子的内源性表达来降低 GVHD 和宿主介导的免疫排斥反应的风险。CAR-T细胞基因修饰有多种技术，包括使用锌指核酸酶 (ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶 (TALENs)、归巢核酸内切酶（巨核酸酶）和CRISPR/Cas9。大量临床前和临床研究有证明了在异基因 CAR-T 细胞中删失一个或多个基因以降低异基因反应性的可行性。

TCR删失（deletion）

GVHD 的发生主要通过由过继转移 T 细胞的α-和β-链 (αβTCR) 组成的 TCR 识别宿主抗原而启动。因此，多种基因编辑方法旨在删失供者T 细胞中的αβTCR表达，可以通过破坏 TCR 相关基因 T 细胞受者α常数 (TRAC) 或 T 细胞受者β常数 (TRBC1/2) 来实现。一些方法通过腺相关病毒 (AAV) 载体将 CAR 转基因位点特异性插入 TRAC 位点，验证了 TCR 基因敲除和 CAR 基因敲入的二合一策略，具有 CAR 表达均匀和插入突变风险降低等多种优势。作为基因编辑的替代方法，研究证明使用 RNA 干扰或在蛋白水平限制 TCR 组分的表达等方法的 TCR 破坏相当。广泛数据显示TCR 删失可行且不损害 CAR-T 细胞抗肿瘤活性，研究异基因 CAR-T 细胞中 TCR 缺失的临床试验首次结果也证明可成功降低 GVHD 发生风险。

HLA分子删失

异基因 CAR-T 细胞的免疫排斥反应主要通过受者CD8+ T细胞识别供者细胞上的 HLA I 类分子来诱导，因此HLAⅠ类分子表达的缺失可降低宿主介导的排斥反应的风险。广泛使用的 HLA I 类删失方法为破坏编码β2-微球蛋白 (B2M) 的基因，它是表达 HLA I 类复合物所必需的。但应注意，由于 MHC I 类分子是NK细胞的关键抑制性配体，MHC I 类分子的缺失可使 CAR-T 细胞易受 NK 细胞介导的裂解，可以采用多种策略来避免 NK 细胞的识别，包括非经典 HLA 分子如 HLA-E 或 HLA-G 的过度表达。除HLA-Ⅰ类外，活化的 T 细胞也上调HLAⅡ类表达。数据表明 CAR-T 细胞中的 HLA II 类分子删失（例如通过破坏编码 II 类主要组织相容性复合体激活剂[CIITA]的基因）可降低内源性CD4+ 细胞的排斥风险。HLA分子删失是改善 CAR-T 细胞持久性的一种有前景的方法，多项临床试验都在研究。

CD52删失和使用抗CD52抗体进行宿主清淋

另一种降低 CAR-T 细胞排斥风险的策略为使用延长清淋的预处理方案。最常用的预处理方案包括氟达拉滨和环磷酰胺（单药或联合），而广泛用于 allo-HCT 环境的抗 CD52 预处理抗体（如alemtuzumab）的额外应用可提供进一步的宿主清淋。然而，鉴于 CAR-T 细胞的半衰期约为6天，抗 CD52 抗体可能会在输注后耗尽。在存在抗 CD52 抗体的情况下，删失异基因 CAR-T 细胞上的 CD52 表达能够使其持续存在，目前正在许多临床试验中进行评价。

使用替代T细胞群作为异基因CAR-T细胞生产的来源

传统αβ T细胞（成熟人CD3+ T细胞中占比最多）是 GVHD 的主要启动因子，为降低 T 细胞异基因反应性，可使用不携带αβ TCR的替代 T 细胞亚群作为制备异基因 CAR-T 细胞的来源，包括γδT细胞（表达γδ TCR）、病毒特异性T细胞（表达限制性病毒特异性TCR）和恒定NK T 细胞（表达恒定TCR）。

γδ T细胞

γδT细胞占外周血中成熟人CD3+ T细胞的1-10%。与表达包含α链和β链的 TCR 并识别 MHC 分子递呈的抗原衍生肽的αβ T细胞不同，γδT细胞的特征是在 TCR 内使用γ链和δ链，并且通常以不依赖 MHC 的方式识别其配体。给予血液恶性肿瘤患者的异基因γδ T细胞可在体内扩增且未引起GVHD。临床前研究证实CAR 转导γδ T细胞的可行性，且数据显示在异种小鼠模型中 CD20 CAR γδT细胞具有抗肿瘤活性（无GVHD），故在 B 细胞恶性肿瘤患者中开展了一项 I 期研究。靶向其他抗原（如NKG2DL）的CAR γδT细胞目前也处于临床评价阶段，强调了γδ T细胞作为异基因 CAR-T 细胞治疗替代细胞来源的潜力。

病毒特异性T细胞

病毒特异性 T 细胞 (VST) 具有对病毒抗原（如巨细胞病毒[CMV]或 EB 病毒[EBV]）具有特异性的TCR。与αβ T细胞相比，VST的 TCR 细胞库受到显著限制，从而降低异常活性的风险，并反映在接受 VST 预防病毒性疾病的患者中无GVHD。临床数据已显示allo-HCT 后 CAR 在自体 VST 及供者来源的 VST上表达的可行性。一项在淋巴瘤患者中研究表达 CD30-CAR 的异基因EBV 特异性 T 细胞的临床试验获得有前景的早期结果，证明其具有抗肿瘤活性，且 GVHD 风险极小。

恒定NK T 细胞

NK T(NKT) 细胞是 T 细胞的一个亚群，与 NK 细胞具有相似的免疫表型和功能特征。部分NKT 细胞表达高度限制性TCR，可识别CD1d（一种单态 HLA I 类样分子）呈递的糖脂抗原。，这些细胞的过继转移称为恒定NKT(iNKT) 细胞，在临床前和临床研究显示减少GVHD。iNKT细胞可作为 CAR iNKT 细胞临床前开发的移植物来源，靶向不同的抗原，包括CD19、CD38、BCMA和GD2。在临床背景下，一项在神经母细胞瘤患者中研究自体 GD2 CAR iNKT 细胞的 I 期研究得出的期中分析证明无剂量限制性毒性，缓解率为25%(3/12)。此外，首批临床试验正在评价异基因 CAR iNKT 细胞在CD19+ B细胞恶性肿瘤中的应用。

使用来自替代细胞群来源的T细胞作为制备异基因CAR-T细胞的来源

作为降低异基因反应性风险的替代方法包括可选择成熟 T 细胞以外的细胞群作为异基因 CAR 产品开发的原始材料，主要为最终分化为可用于异基因 CAR-T 细胞治疗的 T 细胞的替代细胞群，包括诱导多能干细胞、脐血细胞和 T 淋巴祖细胞/前体细胞。此外，大量利用其他免疫细胞类型（如 NK 细胞）的策略也在研究中。

诱导多能干细胞

自我更新的能力使诱导多能干细胞 (iPSC) 成为建立后续细胞扩增细胞库的理想细胞群。含有不同 iPSC 系的细胞库具有来源于 HLA 纯合子供者的常见 HLA 单倍型，可以为个体受者选择 HLA 匹配的 iPSC 系，因此将异基因反应性的概率降至最低。另外，可以选择成功改造的等位基因特异性 HLA 敲除或 HLA 完全破坏的假纯合子 iPSC作为原始材料。使用基因未修饰或修饰的细胞，单个选择的 iPSC 克隆可以产生大量的均质 T 细胞。iPSC来源的 CAR-T 细胞已在临床前模型中证明抗肿瘤疗效，目前正在 B 细胞恶性肿瘤患者中进行临床评价。

脐血细胞

外周血单核细胞 (PBMC) 是制备异基因 CAR-T 细胞的最常用来源。在 allo-HCT 背景下使用脐血 (UCB) 作为移植物来源可降低 GVHD 的发生率和严重程度。UCB来源的 T 细胞显示异基因反应性降低，可以通过其幼稚表型和刺激后细胞因子生成减少来解释；这些优势可用于利用从 UCB 材料中分离的成熟 T 细胞开发异基因 CAR-T 细胞疗法。此外UCB可作为造血干细胞的来源，造血干细胞可分化为 T 细胞，随后进行转导表达CAR。然而需要克服的障碍包括细胞数量较少和供者材料可用性有限，从而可以扩大基于 UCB 的制备方法的适用性。

T淋巴祖细胞/前体细胞

虽然成熟 T 细胞可引起GVHD，但其前体缺乏将宿主组织识别为外源性物质的能力。过继转移后，T细胞前体在受者胸腺中完成分化，并局限于宿主MHC，随后发展为宿主耐受 T 细胞。临床前研究证明包括 CAR 转导 T 淋巴祖细胞/前体细胞在内的基因工程的可行性，这些观察结果提供了对不需要供者和受者之间组织相容性的潜在“现成”方法的洞察，但还需要未来的临床验证。

使用允许HLA不全相合的供者T细胞作为异基因CAR-T细胞生产的来源

在 allo-HCT 中，最常使用与患者HLA-A、-B、-C、-DRB1和-DQB1 完全相合的无关供者（10/10 HLA 相合），且选择额外相合HLA-DPB1 的供者可降低 GVHD 和移植物排斥的风险。鉴于这类供者较少，越来越多的基于 HLA-DPB1 作为模型抗原的证据表明，通过使用HLA 不全相合模型可增加合适供者的数量；根据 T 细胞表位组、相似的免疫肽和/或 HLA 表达水平降低，通过结构相似性定义该模型。临床上，与非 HLA 错配相比，其与移植后风险降低和生存率改善相关。对错配的日益了解可以为选择最佳供者和开发异基因 CAR-T 细胞生产的类似策略提供信息。

总结

•尽管自体 CAR-T 细胞治疗已取得了令人印象深刻的临床疗效，但其广泛应用受到许多后勤挑战的限制。

•使用来自健康供者的异基因细胞开发 CAR-T 细胞有可能实现大规模生产现货型 CAR-T 细胞。

•异基因 CAR-T 细胞治疗发展的最大挑战包括 GVHD 和宿主介导的供者细胞免疫排斥，这两种后果均来自供者和受者之间的免疫差异引起的双向异基因反应性。

•克服 GVHD 和宿主介导的免疫排斥反应的方法包括使用基因编辑技术和使用传统αβ T细胞以外的细胞群作为制备异基因 CAR-T 细胞的来源。

研究议程

•广泛的临床前数据支持异基因 CAR-T 细胞治疗的可行性，首批临床试验在安全性和疗效方面显示可喜结果。

•对临床可耐受的 HLA 不全相合的进一步研究可增加异基因 CAR-T 细胞产生的合适供者的数量，而不增加 GVHD 或宿主介导的免疫排斥的风险。

•除了进一步推进临床前研究和临床评价外，还需要一个包含多种因素的优化基础设施，如后勤、监管和卫生经济学考虑，以最大限度地发挥异基因 CAR-T 细胞治疗的潜力。

参考文献

Sophia Chen, Marcel R M van den Brink.Allogeneic "Off-the-Shelf" CAR T cells: Challenges and advances.Best Pract Res Clin Haematol . 2024 Sep;37(3):101566. doi: 10.1016/j.beha.2024.101566.