北京科技大学郑裕东教授/中国人民解放军总医院彭江主任团队：二氧化锰纳米片掺杂的水凝胶通过减轻炎症和诱导软骨分化来修复软骨损伤

关节软骨缺损后，长期的炎症微环境会阻碍关节软骨的再生与修复, 甚至加剧关节状况恶化。活性氧（ROS）作为炎症微环境的标志之一，通过干扰免疫细胞行为阻碍关节软骨再生。缺氧作为关节炎症微环境的另一个标志，诱导软骨细胞凋亡，因此及时缓解细胞的缺氧状态对于软骨再生修复同样不可或缺。在修复过程中，这两种因素刺激巨噬细胞极化为M1表型，M1表型的巨噬细胞进一步分泌促炎细胞因子和ROS，加重炎症反应，最终导致软骨逐渐退化和关节功能丧失。总之，赋予植入物消除周围微环境中炎症和提供O₂的能力对于软骨再生修复是至关重要的。

北京科技大学郑裕东教授协同中国人民解放军总医院彭江主任团队近日在Biomaterials杂志上发表了题为“A MnO₂ nanosheets doping double crosslinked hydrogel for cartilage defect repair through alleviating inflammation and guiding chondrogenic differentiation”的研究工作。该研究团队开发了一种MnO₂纳米片掺杂的多功能复合水凝胶，该水凝胶可以实现在缺损部位的原位光固化，具有良好的组织粘附性能，同时还具备适当的抗氧化、免疫调节和软骨形成性能。另外，水凝胶中的MnO₂纳米片成分通过催化降解外源性和内源性的H₂O₂产生丰富的O₂，及时缓解缺氧诱导的细胞氧化应激，有效促进骨软骨再生。该研究为关节软骨缺损的修复和骨关节炎等疾病的治疗提供了新的思路（图1）。论文第一作者为北京科技大学博士生赵飞龙和中国人民解放军总医院骨科医学部研究所硕士生贾志博。

图1双交联复合水凝胶的制备，以及通过缓解微环境炎症，诱导软骨分化修复软骨缺损的示意图。

【要点介绍】

本工作利用天然生物大分子壳聚糖作为基材，通过两步酰胺反应和负载MnO₂纳米片制备了用于软骨缺损修复的多功能复合水凝胶。水凝胶可以通过光聚合和邻苯二酚氧化聚合实现双重交联。乙烯基赋予水凝胶光交联性能，邻苯二酚基团的接枝不仅为植入体提供了良好的组织粘附性能。同时，邻苯二酚基团的氧化聚合产生了一定量的外源性H2O2，从而使MnO2纳米片催化降解外源性和内源性的H2O2后产生丰富的O2，及时缓解缺氧诱导的细胞氧化应激，有效促进骨软骨再生。

图2 复合水凝胶的结构与性能表征。(a)、(b) CM和CMDA的1H NMR谱；(c) SEM图像和(d)不同水凝胶的孔径分布；(e) L-MNS-CMDA水凝胶局部元素分布及Mn含量；(f) L-MNS- CMDA水凝胶上MNS的TEM和高分辨率图像；水凝胶的(g) FT-IR光谱，(h)溶胀率，(i)降解率。

图3不同水凝胶的性能。水凝胶的(a)力学曲线，(b)压缩模量，(c)抗压强度；L-MNS-CMDA水凝胶的(d)稳定性，(e)自愈性和(f)可注射性；(g)水凝胶黏附检测示意图；(h)水凝胶的组织粘附强度；(i) L-MNS-CMDA水凝胶在肌肉组织上的粘附图像；(j)水凝胶的静态接触角；(k) L-MNS-CMDA水凝胶的过氧化氢酶样活性和O₂生成。

图4 RAW264.7细胞的免疫调节。(a)与水凝胶共培养12 h后巨噬细胞的F -actin和细胞核染色；(b)基于F-actin染色的细胞周长定量（n = 50）；(c)共培养24 h后，巨噬细胞形态学观察；(d)巨噬细胞增殖；(e)供氧不足和外源H₂O₂提供下的细胞内ROS的荧光图像；(f) Image J软件计算的ROS总荧光面积；(g)供氧不足时，巨噬细胞内HIF-1 α染色；(h) HIF-1 α荧光总面积；(i)缺氧和Lps诱导下巨噬细胞M1标记物（iNOS）和M2标记物（Arg-1）的免疫荧光染色；(j)促炎基因（IL-1β、iNOS）和抗炎基因（IL-4、CD206）的表达水平。

在此基础上，体内实验进一步证实L-MNS-CMDA水凝胶可以显著抑制促炎细胞因子（iNOS, IL-1β, IL-6, TNF-α）的分泌，同时上调抗炎细胞因子（Arg-1, IL-10, IL-4）的表达，表明L-MNS-MDA水凝胶具有理想的炎症调节能力。之后，体内糖胺聚糖，Ⅱ型胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白染色结果表明，相较于其他组中大量的纤维软骨，L-MNS-CMDA水凝胶可以显著地促进透明软骨的再生。新生的软骨表现出良好的力学性能，同时关节功能得到了很好的恢复。

图5水凝胶在植入后2周的免疫调节。(a)新组织及植入体周围组织的H&E染色；(b)巨噬细胞M1标记物（iNOS）和M2标记物（Arg-1）的免疫荧光染色；(c)促炎细胞因子免疫组化染色IL-1β和(d)抗炎细胞因子IL-10；滑膜组织中（e, f, g）促炎细胞因子IL-6、TNF- α、IL-1β和（h, i）抗炎细胞因子IL- 10和IL-4的浓度。

图6 软骨缺损在植入6周和12周后的修复。(a)缺损部位软骨修复的宏观观察；植入后12周后的(b) H&E染色；(d) Ⅱ型胶原免疫组化染色；(e)基于免疫组织化学染色的Ⅱ型胶原定量。

图7 植入后关节功能恢复的评价。植入后6周后(a)再生软骨的力学曲线和(b)弹性模量；植入12周后(c)二维平面足迹和(d)三维足迹；(e)各组大鼠足迹强度；(f)平面足迹的最大接触面积；(g)各组坐骨功能指数（SFI）评分；(h)摇摆时间；(i)大鼠步幅。

【结论与展望】

通过两步酰胺反应和掺杂MnO₂纳米片制备的多功能L-MNS-CMDA水凝胶不仅具有良好的注射性，粘附性能和一定的抗氧化能力，还能有效地将炎症微环境中的H₂O₂分解为O2和H₂O，为细胞行为、分化和组织再生提供了更合适的微环境。双交联网络赋予了L-MNS-CMDA水凝胶的一定的力学性能，为软骨的修复提供了稳定的支撑。体外和体内研究证实L-MNS-CMDA水凝胶能在缺氧促炎微环境下，有效促进巨噬细胞向M2型分化，减少炎症，最后促进关节软骨的再生。总之，L-MNS-CMDA水凝胶在修复软骨缺损方面表现出一定的临床应用潜力。

资金和致谢

作者感谢国家自然科学基金(52273119；51973018);中国人民解放军重点研发项（BWS17J036）；北京市自然科学基金（2222067，L222035）；国家重点研发项目（2022YFB3804303）；北京市科学技术委员会项目(Z191100002019017)的资助。

通讯作者

郑裕东教授：北京科技大学材料学院生物医用材料研究室首席教授，博士生导师。主要研究方向为多功能生物医用复合材料研究。主持和完成了三十余项国家级和省部级及产学研项目研究。发表高水平SCI论文130余篇，多篇高被引，获得国家发明专利授权30多项；多项科研成果获得各级奖励，多项科研成果成功转化。现为国际生物材料联合会fellow，中国生物材料学会常务理事、中国生物材料学会生物复合材料分会副主任委员；中国复合材料学会理事、中国复合材料学会理事生物复合材料学会分会副主任委员等。

彭江教授：中国人民解放军总医院骨科医学部研究所所长，全军骨科战创伤重点实验室主任，主任医师，博士生导师。长期从事骨科再生医学基础研究与组织工程技术临床应用。主攻周围神经损伤修复、股骨头骨坏死再生保髋治疗、骨软骨微组织/类器官研究以及异种组织器官移植。累计发表SCI论文160余篇，H指数41，入选中国骨外科领域高学术影响力学者；获国家发明专利12项；编译撰写专著4部；主导干细胞临床研究备案2项。

原文链接：

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0142961224004095