Adv Mater：高灵敏度、高特异性的新型DNA等温扩增方法：AMPLON

核酸扩增是生物技术和分子诊断的基础。聚合酶链反应（PCR）是核酸扩增、检测和分析的“金标准”技术，但PCR在集中实验室环境外的使用受到了多种挑战的限制。随着核酸扩增（尤其是等温扩增）应用的激增，提高了对先进和精确工程方法的需求。目前，市售等温扩增技术最突出的是基于核酸序列的扩增（NASBA）、链位移扩增（SDA）、环介导的等温扩增（LAMP）、滚圆扩增（RCA）和重组酶聚合酶扩增（RPA），这些方法能以出色的灵敏度扩增靶核酸，使其能够用于诊断检测应用。但这些技术存在稳健性和可靠性的问题，主要是由于依赖相对较低的扩增温度或需要使用涉及大量引物（LAMP和SDA）的复杂设计。为了克服这些挑战，需要开发一种新的简单、快速和高度特异性的等温扩增方法。

近日，美国凯斯西储大学医学院的研究团队在Advanced Materials发表了题为“AMPLON: Amplifying DNA with Multiarm Priming and Looping Optimization of Nucleic Acid”的文章，介绍了一种名为AMPLON的新型DNA扩增方法。AMPLON使用一种新型聚合物材料，具有独特的多臂聚乙二醇（PEG）-DNA引物，可在等温条件下进行高效的DNA扩增。数据显示，AMPLON具有高灵敏度，可检测低至100拷贝/mL的靶标浓度，与使用灵敏引物的实时定量PCR相比，AMPLON能够可靠地鉴定血浆样本中的HIV-1 RNA，一致性达到95%。AMPLON能够在30分钟内实现高度特异性和灵敏的靶标扩增，在改变核酸研究领域和释放医学和生物技术的新可能性方面具有巨大潜力。

美国凯斯西储大学医学院教授、文章通讯作者Mohamed S. Draz表示：“AMPLON有潜力积极改变分子分析和临床诊断的方式，包括从传染病诊断到个性化医疗和环境监测。”

AMPLON引物合成与表征

AMPLON技术依赖于一组独特的三种DNA引物，包括一个多臂DNA环引物（LP）和两个单链DNA引物：起始引物（IP）和解环引物（ULP），它们分别靶向DNA的起始和起端序列。以HIV-1为模型靶标，研究团队设计了一组靶向HIV-1 pol 整合酶基因高度保守区域的引物，能够与LP协同扩增具有高特异性和高灵敏度的靶核酸序列。多臂LP设计有反义（L1）和正义（L2）DNA寡核苷酸（每个长度为20聚体），可特异性互补靶DNA中两个不同但后续的序列（图1）。

研究采用TEM、AFM、琼脂糖凝胶电泳、UV-vis和FT-IR光谱技术评估了PEG-DNA偶联反应的效率和LP的形成，发现在未纯化的情况下，偶联反应产物的TEM观察显示存在无定形PEG结构，DNA链较暗，长度约为10-20nm（图1b）。AFM分析显示，在与DNA偶联后，PEG引物臂高度显著增加，证实了LP偶联物的形成（图1c）。光谱分析证实了PEG和DNA寡核苷酸形成的稳定偶联（图1e）。

图1.多臂引物合成和表征

AMPLON反应设计、优化和表征

AMPLON反应是一种基于DNA引物精确工程设计和协调的高度特异性和快速靶标扩增技术。该反应从LP（具有多臂PEG）与靶序列结合开始，通过反义L1DNA臂启动扩增，与正义L2DNA臂（通过PEG连接到反义臂）进行自启动，产生茎环PEG-DNA杂交结构。其他具有DNA的游离PEG臂启动AMPLON循环步骤，指导多臂扩增子的形成，最终用作AMPLON延伸步骤中的模板以产生多扩增子大结构（图2a）。

研究团队测试了AMPLON反应的效率，发现其在靶标存在下具有特异性扩增，而在对照靶标阴性样本中没有扩增（图2b）。与使用多臂PEG制备的LP相比，使用单臂PEG制备的LP的AMPLON反应中观察到扩增效率显著降低（图2c、d），多臂PEG分子制备的LPs对于高效特异扩增靶向HIV-1核酸至关重要。通过检测不同浓度多臂PEG制备的LPs的AMPLON反应，发现AMPLON的性能直接提高，形成了更多的扩增产物，证明了基于多臂PEG的引物的重要性。PEG链长度和灵活性对于实现有效的模板-引物结合和DNA扩增的重要性（图 2d）。

图2. AMPLON反应设计及机理

此外，研究团队还评估了AMPLON在没有IP和ULP的情况下的性能，发现两种引物在扩增过程中具有关键作用，结果显示具有很强的非特异性扩增（图3a、b）。多臂PEG的存在与靶标的有效自启动、循环和特异性扩增之间存在显著关系。扩增过程取决于LP和ULP的协调活动，通过基于连续的环和非环机制协调靶标扩增。当LP的比例高于ULP时，对AMPLON反应的性能有重大影响，从而导致对照样本中的非特异性扩增（图3c），当ULP的比率高于LP也会产生相同的有害结果，突出了最佳反应性能所需的平衡（图3c）。

图3. AMPLON工作方案和引物选择

为了优化AMPLON反应条件，研究团队测试了不同反应时间和温度对靶标扩增的影响（图4a）。结果显示，随着反应时间的延长和温度的升高，扩增速率显著提高。在扩增反应开始后约15-20分钟，特异性靶标扩增变得可辨别，在70℃左右采用相对较高的反应温度增加了非特异性扩增的可能性（图4a）。

NGS分析进一步揭示了AMPLON反应的特异性，证明超过99.00%的测序reads映射到HIV-1基因组的目标区域或含有源自引物序列的k-mers。这种高度的序列一致性重申了AMPLON反应在选择性扩增HIV-1基因组的预期序列方面的精细特异性（图4c）。

图4. AMPLON优化和扩增子表征

AMPLON反应灵敏度及潜在应用

研究团队使用不同浓度的靶HIV-1序列和乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的非靶向核酸进行实验（图5a、b）。AMPLON技术能够特异性检测靶HIV-1核酸，HBV和HCV的非靶向核酸未检测到扩增产物。与传统PCR和LAMP技术相比，AMPLON技术具有更高的灵敏度，能够将目标浓度扩增至102拷贝/mL。AMPLON反应在广泛的靶标浓度动态范围内能够灵敏检测靶HIV-1核酸，具有稳健性和可靠性（图5b）。此外，AMPLON反应在将血浆样本分类为阳性和阴性方面的一致性为95%，证实了AMPLON在临床环境中检测HIV-1的可靠性和准确性（图6）。

图5. AMPLON 靶标扩增灵敏度

图6. AMPLON在血浆样本中靶标扩增和HIV-1检测的潜在应用

综上所述，研究团队开发的AMPLON方法是利用独特的多臂PEG实现等温扩增。这种创新策略能够快速有效地扩增靶核酸，同时保持出色的特异性和可靠性。通过提供增强的性能和简单的设计和操作，为“金标准”PCR方法提供了一种替代方法，为医疗诊断中的更多应用提供了机会，也为材料科学、生物技术、分子诊断和纳米材料研究领域的未来应用带来了巨大的希望。

论文原文：

Doganay MT, Roman E, Hujer AM, et al. AMPLON: Amplifying DNA with Multiarm Priming and Looping Optimization of Nucleic Acid. Adv Mater. Published online April 24, 2024. doi:10.1002/adma.202311634

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202311634