活体基因编辑，基因突变类疾病未来治疗的希望

科学家首次尝试在人体内进行基因编辑，以便永久性改变人类基因来治愈疾病。该临床试验在美国加利福尼亚完成，受试者是44岁的 Brian Madeux，随着实验展开，上亿个正确的基因拷贝和用来对他本体基因进行精准编辑的工具一起随静脉注射进入他的体内。详细：这一天终于来了：首个人体基因改造疗法正式启动

Madeux 患有的是一种叫做“亨特综合征”（Hunter syndrome）的代谢性疾病，这是一种由于基因突变导致的遗传性疾病，成为第一个受试者让他有点不好意思，但他表示“愿意冒这个风险，并希望通过这个临床试验帮助自己，也帮助其他人”。

一个月之内将会有迹象可以判断这次治疗是否有效，三个月内将会有确切答案。一旦成功，如今初具雏形的基因疗法将会被推动进入爆发式发展阶段。

图 | Brian Madeux 于美国时间 11 月 13 日接受治疗，成为全球首位基因编辑疗法受试者

在此之前，科学家们曾经尝试在实验室中编辑人类细胞，再注射回人体中，虽然同样被称为基因疗法，但却没有对患者 DNA 进行编辑。而且这种基因疗法只能对几种疾病有效，在这有限的疾病范围内，有的治疗效果并不持久，而有的则会因为脱靶效应导致原癌基因表达，进而引发癌症这样严重的新问题。

事实上，安全问题一度阻碍了早期基因疗法的发展，其中一个案例就是 1999 年，一名十八岁的美国少年 Jesse Gelsinger 在接受基因治疗后，因作为载体的病毒引起免疫系统的剧烈反应而死亡，在随后的研究中，科学家们不断努力，发现了更多适合作为载体的病毒，如腺病毒、腺相关病毒等，而在随后的实验中也被证明更加安全。

另一个值得担忧的问题就是一个新基因的插入对于其他基因来说可能存在不可预见的影响。数年前，当研究者尝试用基因疗法来治疗患有免疫系统障碍的“气泡男孩”（bubble boy）病症时，一些接受过基因疗法的患者由于脱靶效应导致原癌基因诱发，最终发展成白血病。

实际上，此前已有多项针对人类胚胎的基因编辑临床试验。早在2015 年，就有消息称中国的一些实验室正在进行基因编辑的人体试验。2015年4月，中山大学的黄军利用基因编辑技术，修复了试验胚胎中一个引发地中海贫血的突变，研究结果发表在《蛋白质与细胞》（Protein & Cell）上。2016年，广州医科大学的范勇在《辅助生殖与遗传学期刊》（Journal of Assisted Reproduction and Genetics）发表论文，宣布修饰了一个可以抵抗艾滋病感染的基因。

2017年8月2日，俄勒冈健康与科学大学胚胎细胞和基因治疗中心的副教授Shoukhrat Mitalipov 在《自然》杂志上发表论文公布了自己的结果。他的研究团队通过CRISPR-Cas9系统修复了MYBPC3突变（这个突变会让心肌变厚，导致青年运动员猝死），整个过程的编辑效率和脱靶率都比之前的研究有提升。这是美国首次人体基因编辑临床试验。不过，这项研究在科学结论方面受到了一些质疑。此外，瑞典，英国等国的学者也已经开始尝试利用基因编辑技术在人体胚胎中修改基因。

然而，这一次，基因编辑以一种更精确的方式在人体中发挥功能。在向人体输送正确基因的同时还加上了小小的分子“医生”，可以将新基因精确的放到目标位置。

“我们切断 DNA，插入新基因，再缝合它，这简直是一种隐形的修补”，加利福尼亚的公司 Sangamo Therapeutics 总裁 Sandy Macrae 如此形容，他们也是此项临床研究的主要发起者，目前该公司已经针对该基因编辑疗法开展了两种代谢疾病，一种血友病的临床试验。

此次使用的基因编辑技术还与大热的 CRISPR 不同，这种基因编辑工具名为“锌指核酸酶（zinc finger nucleases）”，它就像一种分子剪刀，在人体中游走，选择特定的目的基因进行剪切编辑。

锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）又称锌指蛋白核酸酶，是一种人工合成的限制性内切酶，由锌指 DNA 结合域（zinc finger DNA-binding domain）与限制性内切酶的 DNA 切割域（DNA cleavage domain）融合而成。研究者通过加工改造 ZFN 的锌指 DNA 结合域，靶向定位于不同的 DNA 序列，从而使得 ZFN 可以结合复杂基因组中的目的序列，并由 DNA 切割域进行特异性切割。

该疗法由新基因及两个锌指蛋白共三部分组成，编码这三部分的 DNA 序列分别以修饰过的腺相关病毒为载体，通过静脉注射呈递到细胞中。一旦到达肝脏细胞，两个锌指蛋白将识别白蛋白周围的启动子或基因启动-关闭开关序列并进行剪切，并将正确的新基因嵌入。

随后新嵌入的基因可以在白蛋白启动子的作用下，发挥作用，而修饰过的肝细胞就像酶工厂一样开始马不停蹄的生产患者所需要的酶。而事实上，“只要有百分之一的肝细胞被修正，这种代谢疾病就会被成功治疗”，Madeux 的主治医师，同样也是该研究项目的负责人 Paul Harmatz 说到。

“接受治疗后，新的 DNA 会与你自身的遗传信息融为一体，并伴你一生”，Sangamo Therapeutics 总裁 Macrae 说到，但这也意味着选择了就没有回头路，由该项基因编辑疗法导致的任何错误都无法弥补。

“当然试验也有一定的措施确保安全，而且从动物实验来看，结果令人鼓舞”，来自美国国家卫生研究院的 Howard Kaufman 博士说到（他也是通过该项临床试验的陪审团成员之一），“目前还没有任何证据证明基因编辑是危险的，所以现在根本不需要害怕”。

事实上，安全问题一度阻碍了早期基因疗法的发展，其中一个案例就是 1999 年，一名十八岁的美国少年 Jesse Gelsinger 在接受基因治疗后，因作为载体的病毒引起免疫系统的剧烈反应而死亡，在随后的研究中，科学家们不断努力，发现了更多适合作为载体的病毒，如腺病毒、腺相关病毒等，而在随后的实验中也被证明更加安全。

另一个值得担忧的问题就是，一个新基因的插入对于其他基因来说可能存在不可预见的影响。数年前，当研究者尝试用基因疗法来治疗患有免疫系统障碍的“气泡男孩”（bubble boy）病症时，一些接受过基因疗法的患者由于脱靶效应导致原癌基因诱发，最终发展成白血病。

图 | 气泡男孩 由于患有严重的免疫缺陷疾病，气泡男孩只能生活在气泡中

同时，还有一部分人对基因编辑持怀疑态度。他们认为，病毒会进入像心脏、卵子或精子这种地方，可能对子孙后代产生影响。专家介绍，嵌入式的遗传系统保护措施会使该疗法只在肝脏细胞中发挥功能，就像种子一样，只能在特定的环境下才会萌发。

“当随机插入一段基因，可能会拯救你，也可能只是无功也无过，但更可能造成伤害”，来自斯坦福大学的生物伦理学家 Hank Greely 说到，“而该基因编辑的好处是你可以把它插入任何你想放的地方，也只是你希望的地方。”

为了测试该方法的安全性，该项基因编辑试验将会有 30 名成年人接受安全试验，后期也将招募更多的患者进行临床试验，但最终的目标将落脚于治疗儿童这种还未获得严重损伤的年轻人，给予他们更多的生活希望。

“这真算得上是和‘大自然母亲’的玩笑，所有的风险都无法预知，但对于那些不治之症来说，即使再大的风险也值得试一试”，来自圣地亚哥斯克利普斯转化科学研究所的 Eric Topol 博士说到。

而代谢类疾病就是这样的不治之症。目前，全世界患有代谢类疾病患者只有不到 1 万人，很大一部分原因是一旦患有就很难存活。患有亨特综合征的患者，体内缺乏一种可以分解某些碳水化合物的酶。因而这些碳水化合物在细胞中不断地积累，引起发育迟缓，器官问题甚至大脑损伤，最终导致整个身体机能的破坏。

患者可能会经常感冒或耳部感染，同时表现出面部扭曲、听力丧失、心脏问题、呼吸困难等问题，其皮肤、眼睛以及肠胃也会出现问题。“很多患者只能在轮椅上终其一生，依赖父母的照顾直到死亡”，来自明尼苏达大学的遗传学专家 Chester Whitley 说到。

患有这种疾病的患者可以通过每周静脉注射缺少的酶来缓解症状，但每年 10 万到 40 万美元的花费对很多人来说都难以承担，更揪心的是，即使接受注射治疗，也无法阻止脑部损伤的继续。

图 | Madeux 和他的未婚妻 Marcie Humphrey

此次接受治疗的患者就深受亨特综合征的困扰。目前为止，他已经因疝气、拇囊炎、以及耳朵、眼睛、胆囊等的多种问题做过 26 次手术。“似乎每两年我就要做一次手术”，而去年，Madeux 差点因支气管炎和肺炎死亡，这种代谢疾病使他的气管扭曲，无法正常呼吸，“那种感觉就像是我要被我的分泌物淹没窒息了，而我却不能咳出来。”

Madeux 曾是一名厨师，在犹他州和别人合伙经营两家餐厅，手艺精湛甚至为美国滑雪队和社会名流供餐，但如今他却只能告别心爱的厨房。尽管此次基因编辑无法修复他身上已有的损伤，但他希望该疗法可以帮助他不再需要每周进行的静脉注射治疗。

15 年前，当 Madeux 参加一项酶疗法时，他结识了在加州大学旧金山分校贝尼奥夫儿童医院作为护士的 Marcie Humphrey，而今，他们已经订婚了，并且又回到这里接受了基因编辑治疗。

Madeux 的治疗还充满了小插曲，原本这次治疗应该在一周前进行，但却因为一点小问题被推迟了，随后他和他的未婚妻回到亚利桑那州，约定于本周一进行第二次尝试，但谁曾想他们周日的航班竟然被取消了，最终他们赶上了飞往加利福尼亚州蒙特雷的航班，随后坐着时速超过 100 英里的出租车一路向北开往奥克兰。

周一，在 6 名全身防护的医护人员（防止对 Madeux 造成细菌感染）的陪护下，Madeux 进行了 3 小时的注射治疗。他的主治医生 Harmatz 更是在医院陪护了一晚，以确保他的安全。

“我有点紧张，却又非常兴奋”，Madeux 准备离开医院的时候说到，“我这一生都在期待这一刻，期待可以治愈的这一刻。”

实际上，ZFN技术非常复杂，近年来，CRISPR/Cas9 已经成为基因编辑的明星技术,但该技术在体内应用仍然受到诸多限制，比如：使用 Cas9 系统进行组织或细胞特异性基因编辑时，时机和范围难以控制；研究一个或几个基因功能时，需专门制作相应的模型；使用病毒载体进行活体感染时，Cas9 表达框过大从而超过病毒装载容量，限制了其应用。

2014 年 10 月 9 日，Cas9 技术大牛张锋博士的研究团队制作了一个条件性表达 Cas9 蛋白的小鼠，相关工作成为 Cell 封面文章 （Platt et al., 2014）：在 Rosa26 基因位点定点插入 CAG 启动子驱动的 Cas9 表达框，同时以 loxP-STOP-loxP（LSL）阻断 Cas9 的表达，表达 Cre 去除 STOP 元件后可开启 Cas9 表达；Cas9 融合了 EGFP 后可在细胞及组织中的示踪 Cas9 的表达（图一）；采用该模型时，以装载 Cre 表达元件及针对靶基因 sgRNA 的病毒感染目的组织或器官后，即可实现组织特异性基因编辑。为验证此模型的有效性，作者通过慢病毒感染在小鼠骨髓树突细胞中实现了 Myd88 和 A20 的敲除；并用一个名为「KPL」的 AAV（腺相关病毒）载体在肺部敲除了 p53/LBK1 并同时 Kras-G12D 点突变，成功制备肺癌发病模型（图二）。同时作者亦证实，Cas9 蛋白全身持续过表达，未对小鼠产生不利影响 （Platt et al., 2014）。

图一条件型表达 Cas9 的小鼠敲入策略 （Platt et al., 2014）

图二表达 Cre 及 sgRNA 的病毒载体 （Platt et al., 2014）

鉴于表达 Cas9 蛋白的小鼠模型在模型动物制备中的潜力及优势，NBRI 自主研发成功 Rosa26 位点条件性表达 Cas9 的工具鼠（图三）：Cas9 蛋白整合了红色荧光标记 tdTomato,同时为避免 Neo 标记残留对小鼠表型的干扰 （Colledge et al., 1995; Meyers et al., 1998; Olson et al., 1996; van der Hoeven et al., 1996），我们提供的小鼠已去除 Neo 标记，因此可保证 Cas9 在小鼠体内稳定高效的表达。

图三 NBRI rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠

目前南京大学-南京生物医药研究院已经成功研发了 Rosa26-LSL-Cas9-tdTomato 小鼠模型，该模型极大降低了制备基因编辑小鼠模型的技术门槛。

匹兹堡大学的研究人员已成功测试了一种基因编辑技术，可以将艾滋病毒从动物活体中清除！该科学团队使用CRISPR / Cas9的基因编辑技术。在以前的研究的基础上，新研究表明该技术在两个额外的小鼠模型中是有效的，其中一个小鼠细胞中遭受急性艾滋病毒感染，另一个注射了来自人类细胞中的艾滋病毒，结果艾滋病毒HIV-1基因在RNA中的表达下降了60％95％。

科学家使用最先进的成像系统来跟踪HIV感染细胞的精确位置，该系统使研究人员能够在HIV-1感染潜伏的细胞中实时观察HIV-1并且基本上看到HIV-1的实时状况。 科学家希望他们的这一个实验可以成功将转化为治疗人类艾滋病的有效结果。

下一个阶段将是在艾滋病毒感染诱发疾病的灵长类动物模型中重复研究，以进一步证明在潜伏感染的T细胞和其它细胞中HIV-1的消除的效率，包括脑细胞。基因工程与生物技术资深研究调查员Kamel Khalili说，我们最终的目标是在人类患者中进行临床试验，希望可以彻底解决困扰人类生存的这个难题！

除此之外，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术通过体外靶向和修复源自X连锁慢性肉芽肿病（X-linked chronic granulomatous disease）患者体造血干细胞中的缺陷基因（CYBB），并将编辑后造血干细胞移植至体内实现这些经过修复的造血干细胞产生了功能正常的白细胞（DOI: 10.1126/scitranslmed.aah3480）。使用CRISPR-Cpf1（Cpf1比Cas9酶小很多，这就使之更容易包装到病毒内，因此也更加容易进入肌细胞）基因编辑系统，在人类心肌细胞和动物模型中实现了杜氏肌营养不良突破基因的靶向和修复，可以有效治疗此类疾病（DOI: 10.1126/sciadv.1602814）。CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗亨廷顿舞蹈症的动物试验证据，在亨丁顿舞蹈症模式小鼠中利用通过病毒载体运送的CRISPR/Cas9切除它们的脑细胞中的mHTT基因的一部分，使得亨廷顿蛋白聚集物几乎消失了（DOI:10.1172/JCI92087）。CRISPR引入有益的血红蛋白突变基因，可治疗危及生命的血液疾病，利用基因编辑技术CRISPR将一种有益的自然突变（British-198）引入到血细胞中，能够开启胎儿血红蛋白（foetal haemoglobin）产生，这一进展可能最终导致人们开发出治愈镰状细胞性贫血和其他的血液疾病的方法（DOI: 10.1182/blood-2017-02-767400）。

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