CLIN CHEM：单错配对引物延伸的影响
2018-05-23 MedSci MedSci原创
等位基因特异性PCR通过优先扩增特定等位基因，因而是一种重要的诊断工具，鉴定单核苷酸变异。 研究人员应用荧光停流聚合酶测定来测量寡核苷酸发夹的延伸速率。在PCR适用条件下，反应速率以每个聚合酶的核苷酸/秒记录（nt / s / poly）。在水生栖热菌（Taq）DNA聚合酶缺失突变体和135个寡核苷酸序列研究了温度，氯化钾，错配类型和位置的影响。 研究发现，对于匹配的模板，65℃下的扩
等位基因特异性PCR通过优先扩增特定等位基因，因而是一种重要的诊断工具，鉴定单核苷酸变异。
研究人员应用荧光停流聚合酶测定来测量寡核苷酸发夹的延伸速率。在PCR适用条件下，反应速率以每个聚合酶的核苷酸/秒记录（nt / s / poly）。在水生栖热菌（Taq）DNA聚合酶缺失突变体和135个寡核苷酸序列研究了温度，氯化钾，错配类型和位置的影响。
研究发现，对于匹配的模板，65℃下的扩增速率在205±11和177±8nt / s / poly之间，对于3'-错配模板，在4.55±0.21和0.008±0.005nt / s / poly之间。尽管延伸率随着距3'末端的距离增加而逐渐增加，但从3'末端C·C错配6个碱基的比率仍然降低多达84％。匹配序列的最佳延伸温度为70℃，3'错配改变为55-60℃。KCl抑制错配延伸。与匹配的模板相比，Michaelis常数（K m）增加且3'错配表观单分子速率常数（k cat）降低。
研究表明，尽管引物延伸错配取决于错配类型和位置，但变异还取决于局部序列，KCl浓度和聚合酶的类型。引入3'错配会降低延伸的最佳温度，提示退火温度较高可以获得更好的等位基因鉴别。对等位基因特异性PCR中预期特异性的定量描述提供了额外的设计方向，并建议什么时候选择其他方法（例如高分辨率熔解分析）可能更好。
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